黃芪甲苷對人類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞增殖及白細胞介素6分泌的影響*

馮美杰，李 蕾，王穎航，徐兢鴻，潘 志△

(1. 長春中醫(yī)藥大學，長春 130117；2. 長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)屬于系統(tǒng)免疫性疾病，發(fā)病機制目前尚未完全明確。RA的病理變化常表現(xiàn)為關節(jié)滑膜受到破壞，治療不及時或治療不當可引起關節(jié)嚴重畸形和關節(jié)功能障礙[1-2]。

研究發(fā)現(xiàn)，激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號傳導通路是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導RA發(fā)病的主要原因，MAPK通路有C-Jun氨基末端激酶、P38和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶三類不同的激酶。研究表明，TNF-α能夠明顯提高人類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞(human fibroblast-like synoviocytes，HFLS-RA)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化水平，快速激活MAPK通路，在TNF-α濃度為10 ng/mL時這種誘導能力最為明顯[3-4]。黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)作為黃芪活性成分之一，具有非常廣泛的生物學效應[5]。此外，黃芪在RA的臨床治療中顯現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，但其作用機理尚不清楚。因此，本實驗采用TNF-α及黃芪甲苷干預細胞以探討其分子作用機制。

1 材料

1.1 儀器與試劑

SW-CJ-1D超凈臺(上海喬躍電子有限公司);XDS-100C型倒置顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司);MCO-15AC二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司);RT-6100酶標儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司);3H16RI智能高速冷凍離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司);165-8000電泳儀(美國伯樂公司);H-DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司);胎牛血清(美國Gibco公司);黃芪甲苷標準品(上海源葉生物科技有限公司);TNF-α(美國PEPROTECH公司);MTT(美國Sigma公司);二甲基亞砜(美國Sigma公司);Rat 白細胞介素6 (Interleukin-6，IL-6)、ELISA KIT試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒增強型(中國碧云天生物有限公司);c-Jun氨基末端激酶1 (JNK1)抗體(北京博奧森生物技術有限公司);c-Jun氨基末端激酶1/2 (JNK1/2)抗體(北京博奧森生物技術有限公司);Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.2 細胞

HFLS-RA購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，取3～7代用于實驗。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將HFLS-RA迅速放入37 ℃溫水中，小心快速搖晃至細胞懸液全部溶解，在無菌條件下將細胞懸液移入無菌離心管中，加入培養(yǎng)液后離心棄去上清液，在離心管中加入1 mL培養(yǎng)液，將細胞沉淀混懸，小心吸取移到含有3 mL 10%胎牛血清(FBS)H-DMEM培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。本實驗研究所用細胞為3代到7代[6]。

2.2 細胞分組及干預方法

細胞按隨機數(shù)字表法分為5組，空白組：10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；TNF-α組：10 ng/mL TNF-α；AS-ⅣH組：10 ng/mLTNF-α+100 μg/mLAS-Ⅳ；AS-ⅣM組：10 ng/mLTNF-α+50 μg/mLAS-Ⅳ；AS-Ⅳ L組：10 ng/mLTNF-α+25 μg/mL AS-Ⅳ(依據(jù)文獻以及前期預實驗確定本實驗黃芪甲苷的濃度[7])。

2.3 MTT法檢測HFLS-RA的增殖活力

當細胞生長到滿足傳代條件時(80%)，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，并將細胞密度調(diào)整為1×104。按照每孔200 μL將細胞懸液接種于96孔板，將其置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照實驗分組加藥，24 h后加入MTT、DMSO，在490 nm處測定OD值[8-9]。

2.4 ELISA法檢測HFLS-RA上清液中IL-6的表達水平

實驗分組、加藥刺激方法同上，加藥后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集各組細胞上清液，離心后放于-20 ℃保存，按照說明書步驟測定IL-6含量[10-11]。

2.5 Western Blot法檢測細胞中JNK1和JNK1/2蛋白表達水平

提取單層貼壁細胞總蛋白，按照增強型BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，計算電泳上樣體積。將蛋白樣品置于100 ℃沸水中煮10 min，使蛋白完全變性。制膠(12%分離膠、5%濃縮膠)，上樣后以SDS-PAGE電泳法分離蛋白質(zhì)(80 V 30 min跑濃縮膠，110 V 90 min跑分離膠)，電泳結束后將分離開的蛋白轉(zhuǎn)膜(100 V 85 min)，5%脫脂奶粉封閉2 h后，TBST洗膜3～5次, 每次10 min。孵育一抗4 ℃過夜；室溫搖床上孵育二抗1 h，ECL化學發(fā)光，于成像系統(tǒng)曝光并測定灰度值[12]。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 AS-Ⅳ對TNF-α誘導的HFLS-RA增殖抑制作用

表1示，與空白組比較，TNF-α組HFLS-RA增殖活力明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與TNF-α組比較，AS-Ⅳ各組HFLS-RA的增殖活力受到明顯抑制，其中AS-ⅣH的抑制作用最為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 AS-Ⅳ對TNF-α誘導的HFLS-RA增殖抑制作用

3.2 AS-Ⅳ對TNF-α誘導的HFLS-RA 中IL-6表達的影響

表2示，與空白組比較，TNF-α組HFLS-RA上清液中IL-6表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，不同濃度AS-Ⅳ組HFLS-RA上清液中所檢測的IL-6含量明顯降低，其中AS-ⅣH組的IL-6表達水平最低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3.3 AS-Ⅳ對TNF-α誘導的HFLS-RA 中JNK1、JNK1/2表達的影響

圖1示，與空白組比較，TNF-α組的HFLS-RA內(nèi)JNK1、JNK1/2蛋白含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與TNF-α組比較，AS-Ⅳ各組蛋白含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中AS-ⅣH的抵制作用最為明顯。

注：1.空白組；2.TNF-α組；3.AS-ⅣH組；4.AS-ⅣM組；5.AS-ⅣL組；與空白組比較：*P<0.05；與TNF-α組比較：#P<0.05圖1 各組HFLS-RA JNK1和JNK1/2的表達

表2 各組HFLS-RA上清液中IL-6表達水平

4 討論

中醫(yī)根據(jù)RA的臨床表現(xiàn)和發(fā)生發(fā)展過程將其歸于“痹證”范疇，外邪、營衛(wèi)不和、素體虧虛是導致痹證的主要原因。目前多數(shù)醫(yī)家對痹證的治療有一定的共識。如趙靖強調(diào)痹證治療應以扶正祛邪為治則，以溫陽行痹為治法[13]。黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分之一。黃芪作為傳統(tǒng)中藥材具有扶正補氣、固腠理之功效，還可利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌[14]，因而臨床常用黃芪扶正祛邪以治療因虛致痹的病證?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、降低血小板黏附力等作用[15-17]。RA的主要特點是滑膜組織增生和關節(jié)結構破壞，造成滑膜組織增生和關節(jié)結構破壞的主要原因是，RA患者成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)的增殖和凋亡平衡失調(diào)，使FLS不斷地 “腫瘤樣”增生[18]。有研究表明，TNF-α能刺激滑膜細胞、成纖維細胞、破骨細胞和軟骨細胞產(chǎn)生破壞性物質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶，導致RA患者滑膜的炎癥持續(xù)加重，漸進性破壞軟骨與骨組織[19]。IL-6是RA的致病源頭因素之一,它參與RA致病過程中早期B細胞和T細胞的活化，并參與全程致病過程。TNF-α能促進滑膜細胞中IL-6的產(chǎn)生，IL-6也能增強TNF-α等細胞因子的促炎效應，因此本實驗選擇IL-6作為評價指標[20]。JNK信號通路參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學反應，其可被細胞因子、表皮生長因子等多種因素激活，JNK信號通路功能異常可造成慢性炎癥和神經(jīng)退行性病變等多種疾病[21-22]。JNK磷酸化和膠原酶的基因表達恰恰需要TNF-α的誘導，JNK已被鑒定的亞型為1、2和3，JNK1和JNK2基因在全身廣泛表達, 而JNK3呈限制性表達，JNK2不足只在關節(jié)炎的臨床前模型有所顯現(xiàn)，但JNK1不足可以減輕滑膜炎癥和關節(jié)破壞，JNK1也有利于破骨細胞分化。這些都表明，JNK參與RA的滑膜炎癥和關節(jié)破壞并可能在RA疾病進程中定位，JNK有望成為臨上的一個潛在的治療靶點，調(diào)節(jié)相關疾病的發(fā)生發(fā)展。

本研究顯示，體外培養(yǎng)的RA-HFLS經(jīng)TNF-α刺激24 h后，HFLS-RA增殖活力明顯升高，隨著AS-Ⅳ濃度的增加，HFLS-RA增殖活力逐漸降低，AS-Ⅳ作用濃度與細胞增殖活力之間存在依賴關系。TNF-α能促進滑膜細胞分泌IL-6，從而使炎癥加重、軟骨破壞。經(jīng)過黃芪甲苷的干預后，IL-6的水平顯著下降，說明黃芪甲苷可通過抑制炎癥細胞因子來控制疾病的炎癥反應。Western blot檢測滑膜細胞蛋白的表達情況顯示，JNK1和JNK1/2蛋白在HFLS-RA模型組中表達明顯增加。隨著AS-Ⅳ濃度升高，JNK1和JNK1/2蛋白表達水平表現(xiàn)為逐漸降低趨勢，表明AS-Ⅳ抑制TNFα誘導HFLS-RA細胞增殖呈劑量依賴性。本研究表明，AS-Ⅳ可抑制TNF-α誘導HFLS-RA增殖，減輕滑膜炎癥，其分子機制可能與調(diào)控JNK信號傳導通路的異?；罨嘘P。但AS-Ⅳ對HFLS-RA的作用不僅僅通過抑制JNK信號通路蛋白磷酸化實現(xiàn)，可能還有其他信號通路參與其中，今后尚需進一步研究。