補腎化痰法經Sphk1通路調控肥胖PCOS雌鼠子宮內膜容受性的研究*

陳美佳，徐曉娟，黃映紅，田雪梅，張 淼，熊 倩

(成都中醫藥大學，成都 610072)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是以生殖內分泌及代謝功能異常為特征的卵泡發育障礙性疾病[1]。目前，由于生活飲食習慣及環境的影響，臨床發病率日益增高，育齡期婦女的發病率為5%～12%[2]，是全球卵巢性不孕的最主要疾病之一，占不排卵性不孕的50%～70%[3-5]。PCOS的西醫治療主要包括降低雄激素、促排卵、調整月經周期等方法，但療效欠佳，臨床妊娠率低于40%[6]，且早期流產率高達50%[7]。既往研究證實，PCOS高流產率與子宮內膜容受性(endometrial receptivity，ER)下降有關[8]。ER是指在種植窗口期子宮內膜允許胚胎植入的最佳容受狀態，具有時效性，僅在排卵后7～8 d內局部內膜組織發生一系列改變以容受胚胎著床[9]。因此，改善PCOS不孕患者ER成為提高其妊娠率的關鍵問題。對PCOS患者進行中醫證候分析發現，約有40%～50%的患者被辨證為腎虛痰濕證[10]，肥胖是其典型臨床特征之一。本課題組認為，腎虛痰濕是肥胖PCOS的關鍵病機，補腎化痰法是中醫治療本病的根本治法。本研究基于Sphk1通路探討補腎化痰法改善肥胖PCOS雌鼠ER的效應及機制,為補腎化痰法的臨床運用及選方用藥提供可靠的實驗支持。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD雌鼠120只，由成都達碩生物科技有限公司提供，動物許可證SCXK[川]2015-030,體質量(180～200) g，7～8周齡適應性喂養7 d后納入實驗。室內保持每日10 h/14 h光暗交替，標準飼料喂養，自由攝食飲水，室溫控制在22～25 ℃，相對濕度40%～70%，專人及時更換大鼠墊料。本實驗已通過成都中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 藥物制備

補腎化痰法擬方藥物組成: 菟絲子30 g，覆盆子30 g，桑椹子30 g，補骨脂10 g，鹿角霜10 g，紫河車10 g，茯苓20 g，陳皮15 g，車前子15 g，肉蓯蓉15 g等，統一制備藥物濃度為含生藥濃度5 g/ml、10 g/ml、20 g/ml的低、中和高劑量儲存液，臨用時稀釋。二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司,生產批號14030657)用法:將1片二甲雙胍溶于50 ml羧甲基纖維素中，制備二甲雙胍混懸液，劑量300 mg/(kg·d)。

1.3 主要試劑

雌二醇(Estradiol，E2，ELISA KIT，貨號ZC-36464)、孕激素(Progesterone，PROG，ELISA KIT，貨號ZC-37569)、睪酮(Testosterone，T，ELISA KIT，貨號ZC-36635)試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司。孕激素受體(Progesterone receptor，PR)第一抗體(兔多克隆抗體，1∶150，bsm-33169 M)及雌二醇受體(Estradiol receptor，E2R)第一抗體(兔多克隆抗體，1∶300，bs-0116R)購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.4 肥胖PCOS動物模型建立

將120只雌鼠隨機選取20只作為空白對照組(以下簡稱空白組)，其余100只雌鼠給予0.5 mg /(kg·d)濃度的來曲唑及高脂乳劑 (豬油+膽固醇，其質量比為10∶3)，灌胃體積為15 mL/(kg·d)，每日上午9點進行灌胃，連續造模28 d。造模第18天開始行陰道脫落細胞涂片觀察，大鼠動情周期為5 d，鏡下連續觀察2個周期動情周期的陰道涂片變化，動情周期紊亂者提示造模成功，將造模成功的雌鼠納入后續實驗共計100只。

1.5 動物分組及給藥

將造模成功的PCOS雌鼠100只按隨機數字表法分為模型組、中藥低、中、高劑量組(分別以16.65 g/kg，41.63 g/kg，83.25 g/kg中藥干預，相當于70 kg成人用藥等效劑量、等效劑量的2.5倍、等效劑量的5倍，以下簡稱低劑量組、中劑量組、高劑量組)、陽性對照組(二甲雙胍300 mg/kg干預,相當于70 kg成人用藥等效劑量的2.5倍)5組各20只。空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，中藥各劑量組和陽性對照組給予相應藥物灌胃，各組給藥體積均為1 ml/100 g，連續治療21 d后停藥。

1.6 標本采集及指標檢測

1.6.1 動情周期檢測 自造模處理第18天起，各組大鼠每日進行陰道涂片檢測，巴氏法染色，連續觀察10 d。

1.6.2 體質量檢測 雌鼠在適應性喂養7 d后稱重為初始體質量，然后每3 d稱重并記錄，直到處死前稱取最后1次體質量。

1.6.3 ELISA法檢測血清E2、PROG及T濃度 停藥后12 h各組大鼠均以10%水合氯醛按0.3 ml/100 g體積注射麻醉處死，心尖采血，4 ℃冰上靜置20 min，以3500 r/min離心15 min取血清，-20 ℃保存備用。采用ELISA法檢測血清E2、PROG及T濃度。

1.6.4 子宮組織病理切片染色 每組隨機選擇10只大鼠，取左側子宮組織常規脫水、修剪、包埋、切片5 μm、HE染色、封片，使用BA200Digital 數碼三目攝像顯微攝像系統(麥克奧迪實業集團公司生產)觀察，分別在×40、×100、×400下觀察并采集所需圖片，分析子宮組織的病理形態改變并計數腺體個數。

1.6.5 免疫組織化學法檢測子宮內膜E2R、PR表達 每組選擇6只大鼠，將蠟塊切片、脫蠟，3%甲醇雙氧水室溫10 min，PBS洗3次，浸入0.01 M檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，微波爐中高火加熱至沸騰后斷電，PBS洗2次，滴加山羊血清封閉液，室溫20 min，滴加一抗，4 ℃過夜，滴加生物素化二抗，37℃30 min，PBS洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、中性樹膠封片光鏡下觀察，以細胞質顯示棕黃色均染或顆粒為陽性表達。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定陽性染色的光密度(integrated optical density，IOD)和面積(Area)，計算平均光密度值(Mean density，MD)，使用3張圖像的MD計算平均數，得出E2R、PR的平均光密度值。

1.6.6 RT-PCR法檢測子宮Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1的mRNA表達 表1示，每組取6只雌鼠的右側子宮組織進行檢測。TRIZOL提取子宮組織中總RNA，依次進行RNA質量檢測、電泳、消化、反轉錄；依次用SYBR Primix Ex TaqⅡ(2×)、PCR Forward Primer(0.4 μmol/L)、PCR Reverse Primer(0.4 μmol/L)、cDNA、ddH2O試劑進行擴增40個循環，在60 ℃～95 ℃進行溶解曲線分析。使用Thermo Scientific PikoReal軟件(Thermo公司)分析PCR過程各檢測樣本的CT值。β-actin作為內參，通過2-△△CT計算子宮組織鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，Sphk1)、1型1-磷酸鞘氨醇受體(sphingosine 1-phosphate receptor 1，S1Pr1)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、細胞周期蛋白1(cyclin dependent 1，CyclinD1)mRNA相對表達水平。

表1 RT-PCR檢測所用引物及堿基序列

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 動情周期檢測結果

圖1示，陰道涂片行巴氏染色于顯微鏡下觀察發現，模型組一直處于動情間期，動情周期失去規律性變化，而空白組處于動情期，并保持規律的動情周期。

圖1 雌鼠陰道脫落細胞涂片比較(×100)

2.2 體質量與腺體數量

表2示，與空白組比較，模型組肥胖PCOS雌鼠體質量顯著上升(P<0.01)，腺體個數顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，中藥各組體質量顯著下降(P<0.01)，腺體個數顯著上升(P<0.01)。

表2 各組大鼠體質量及腺體個數比較

2.3 補腎化痰法對肥胖PCOS雌鼠血清性激素的影響

表3示，與空白組比較，模型組雌鼠血清PROG、E2濃度降低(P<0.01或P<0.05)，T濃度升高(P<0.01)；與模型組比較，高劑量組雌鼠血清PROG、E2濃度升高(P<0.05)，T濃度降低(P<0.05)。

表3 各組雌鼠血清E2、PROG、T濃度比較

2.4 子宮內膜病理形態變化

圖2示，與空白組比較，模型組子宮處于發情前期, 子宮內膜較多腺上皮細胞發生空泡變性、點狀壞死、細胞核固縮甚至溶解消失，且固有層見大量淋巴細胞浸潤，肌層的肌纖維水腫、變性，提示模型組子宮發育滯后且子宮內膜受損；與模型組比較，中藥組子宮可能處于發情期，子宮內膜明顯增生，內膜變厚，固有層組織疏松水腫且見大量淋巴細胞浸潤；肌層肌纖維平行排列整齊、致密，提示中藥組與空白組子宮內膜發育同步，說明補腎化痰法能改善子宮內膜受損。

圖2 雌鼠子宮形態HE染色比較(×400)

2.5 補腎化痰法對肥胖PCOS雌鼠子宮E2R、PR的影響

圖3、4表4示，PR陽性產物主要分布在細胞漿，E2R陽性產物主要分布在細胞核和細胞漿。與空白組比較,模型組雌鼠子宮組織PR、E2R平均光密度值升高(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，高劑量組雌鼠子宮組織PR、E2R平均光密度值降低(P<0.05或P<0.01)。

注：A.空白組；B.模型組；C.陽性對照組；D.高劑量組；E.中劑量組；F.低劑量組圖3 子宮組織E2R蛋白的免疫組化染色比較(×400)

表4 各組雌鼠子宮E2R、PR蛋白含量比較

2.6 補腎化痰法對肥胖PCOS雌鼠子宮Sphk1通路的影響

表5示，與空白組比較，模型組雌鼠子宮內膜組織中Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1mRNA表達明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，高劑量組大鼠子宮中Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1mRNA表達升高(P<0.01或P<0.05)。

表5 各組雌鼠子宮Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1mRNA表達

3 討論

本課題基于補腎化痰法的補腎化痰擬方乃五子衍宗丸與蒼附導痰湯化裁。五子衍宗丸是補腎方，能提高黃體功能，改善激素水平和子宮內膜容受性，從而提高妊娠率[11]；蒼附導痰湯是治痰方，研究顯示蒼附導痰丸治療肥胖型PCOS療效顯著[12]。補腎化痰擬方中菟絲子、桑椹子、覆盆子、肉蓯蓉、鹿角霜、補骨脂等補腎中之陰陽，紫河車補腎精而益沖任，車前子補中有瀉以防滋膩，陳皮、茯苓燥濕化痰，諸藥合用補瀉兼施、標本同治，可有效調經助孕。本課題組前期重點研究了卵巢顆粒細胞的增殖、凋亡與生殖性激素及糖脂代謝改變的相關性，而未涉及影響妊娠結局的重要靶器官子宮內膜。因此，本課題深入研究補腎化痰法調控肥胖PCOS子宮內膜容受性的作用機制。

肥胖可通過高雄激素、胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)等多種途徑影響肥胖PCOS患者的生育能力，但肥胖對于PCOS子宮內膜容受性的影響機制卻常常被忽視。肥胖使血糖升高產生大量胰島素，發展成為高胰島素血癥、IR，卵巢局部的IR導致T升高。T可加速內臟脂肪分解產生更多游離脂肪酸，刺激胰腺β細胞產生更多的胰島素，加重IR[13]形成惡性循環。高雄激素水平可促進內臟沉積脂肪，脂肪細胞也能儲存雄激素樣類固醇，造成脂肪組織中類固醇濃度遠遠高于血漿，故肥胖者的類固醇池更大[14]，說明肥胖會加重生殖內分泌紊亂。子宮內膜是性激素作用的直接靶器官，雌孕激素可以維持內膜的容受性[15]。E2、PROG的生理效應依賴E2R及PR的介導。有臨床研究顯示[16]，肥胖PCOS患者子宮內膜增殖期E2R、PR增多，PCOS患者長期存在無成熟卵子排出的現象，使體內E2水平變化不大，且由于缺乏PROG的拮抗作用，E2R、PR持續高表達，使子宮內膜長期在低E2作用下增生。子宮內膜是胰島素的靶器官之一，研究顯示[17]，PCOS患者子宮內膜上皮細胞胰島素受體明顯升高，提示PCOS患者子宮內膜存在局部IR。正常的葡萄糖代謝促進子宮內膜細胞的分化和成熟，載體葡萄糖轉運蛋白-4(glucose transporterfactor-4，GLUT4)以胰島素為介導轉運葡萄糖，在子宮內膜腺體組織的成熟過程中起重要作用。本課題組前期課題研究[18]發現，肥胖PCOS大鼠體內GLUT4表達降低，說明其對葡萄糖的轉運能力下降，子宮內膜細胞對葡萄糖的利用差，直接影響內膜糖代謝水平。

肥胖PCOS患者生殖性激素及代謝內分泌紊亂，子宮內膜無法向分泌期轉化，其血管生成及螺旋化受阻，必然導致子宮內膜容受性下降，妊娠結局不良。內膜的發育少不了血管的參與，Sphk1作為一種蛋白激酶，主要存在于血管內皮細胞中，其作用是調節細胞生命活動，其周期性表達受E2R,、PR等調節。當Sphk1受到刺激后生成S1P促進血管愈合與胚胎發育，S1P與其受體S1Pr1結合活化磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt通路，激活下游Cyclin D1，CyclinD1是細胞周期素家族中與細胞增殖周期關系較為密切的分子，在細胞增殖調節中起重要作用[19]。在生理條件下[20-21]，作為細胞周期調節因子，CyclinD1可以激活啟動細胞周期然后聯系細胞外信號環境，激活因子生長因子受體并激活多條信號通路，控制G0期過渡G1再轉變S期，促進細胞增殖和子宮內膜血管生成。

本實驗結果顯示，模型組雌鼠動情周期失去規律，體質量明顯增加，血清性激素紊亂，子宮發育滯后且子宮內膜形態受損，提示肥胖PCOS模型建立成功。模型組血清中T持續高表達，然后向E2轉化被抑制，故E2含量降低。由于排卵障礙，血內PROG含量降低，說明肥胖加重生殖內分泌紊亂；模

型組PR、E2R蛋白含量明顯升高，說明肥胖加重PCOS并導致子宮內膜容受性下降；Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1 mRNA表達明顯降低，故推測肥胖PCOS可能上調E2R、PR表達，影響Sphk1的激活，阻礙Sphk1通路，進而影響細胞增殖、子宮內膜血管生成。經補腎化痰法干預后，中藥治療組體質量增長得到有效控制，說明補腎化痰法能改善肥胖PCOS雌鼠肥胖狀態。中藥高劑量組雌鼠T下降，PORG、E2上升，說明該法能調節肥胖PCOS雌鼠生殖內分泌紊亂，維持E2、PROG平衡，糾正PCOS高雄狀態，使子宮處于良好的內環境中。中藥高劑量組子宮組織PR、E2R蛋白含量下降，Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1 mRNA表達上升，故推測補腎化痰法通過調控E2R、PR表達，增加Sphk1表達，激活PI3K/Akt信號傳導通路，上調CyclinD1表達，促進細胞增殖和子宮內膜血管生成，改善子宮內膜形態，發揮其改善子宮內膜容受性的作用。