生鮮豬肉肌細胞內外間隙和水分狀態與持水性的關系

李華健，陳 韜，楊波若，李燕清，卞健科，舒國濤

（云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

中國是豬肉生產和消費大國，2018年豬肉產量達5 404萬 t，約占世界豬肉總產量（1.13億 t）的48%[1]，豬肉品質的優劣直接影響著我國肉類工業的經濟效益。肉的持水性即肉類保持自身水分和人為加入水分的能力[2-3]，是影響肉品質量和企業經濟效益的主要指標之一，業內常用汁液流失率來反映肉的持水性[4-5]。據估計，肉的汁液流失率每增加1%就可能給一個大型肉類加工廠每天造成數千元的經濟損失[6]。所以，汁液流失形成的機制和控制技術一直是肉類科學研究的熱點。其中，肌肉微結構變化與持水性的關系是主要研究方向之一。Huff-Lonergan等[7-8]提出肌細胞結構的改變可以控制肌細胞和肌肉中水分的保留或損失，其認為宰后僵直過程中肌細胞間和肌束間空隙（又稱為汁液流失通道）的形成會導致較多的汁液流失；李俠等[9]觀察到豬肉貯藏過程中纖維束間隙增大，不易流動水逐漸態變為自由水，肉的持水性降低；Sch?fer等[10]的研究表明肌細胞外間隙面積的變化解釋了汁液流失率變異的39%。由于大多數研究采用光學顯微鏡觀測肌肉微觀結構，不能分清汁液流失通道形成于肌細胞內還是肌細胞外，所以，汁液流失通道形成位置依然存在爭議。如Kristensen[11]和Bertram[12]等認為汁液流失通道形成于肌細胞外，而Lawson等[13]的汁液流失通道形成假說則認為汁液流失通道形成于肌細胞內。近年來，低場核磁共振技術被廣泛應用于肉與肉制品的水分狀態和含量的測定及相關研究中[14]。Han Minyi等[15]通過研究發現低場核磁共振的橫向弛豫時間（T2）和豬肉肌原纖維蛋白凝膠微觀結構變化具有良好的相關性。因此，本研究結合透射電子顯微鏡和低場核磁共振技術測定肌原纖維與肌細胞膜之間的距離（肌細胞內間隙）、肌細胞之間的距離（肌細胞外間隙）和不同狀態水分的相對含量，分析它們與汁液流失率的關系，以便更好地了解汁液流失形成的原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇品種相同、 飼養條件相同、 體質量（（105±5）kg）相似的商品肉豬在曲靖市某商業屠宰廠進行屠宰。

體積分數25%戊二醛、乙醇（均為分析純） 廣東西隴化工廠；丙酮（分析純） 湖北齊飛醫藥化工有限公司；環氧樹脂（Epon-618） 天門恒昌化工有限公司；檸檬酸鉛 湖北津樂達化工有限公司；醋酸鈾 北京中科光析化工技術研究所；四氧化鋨 山東西亞化學工業有限公司；二甲苯（分析純） 上海試劑廠；甲醛（分析純） 汕頭市達濠精細化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

H I 9 0 2 5 C 便攜式p H 計 意大利哈納公司；CR-400/410色差儀 日本美能達公司；JEM-1011透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；R型超薄切片機切片德國徠卡公司；NMI20-Analyst核磁共振成像分析儀上海紐邁電子科技有限公司；1、2 cm雙片刀由實驗室自制。

1.3 方法

1.3.1 生鮮豬肉的處理及分組

按照Warner等[16]的方法，根據宰后45 min的pH值和肉色選擇出10 條疑似正常背最長肌肉和10 條疑似PSE（pale, soft, exudative）背最長肌肉。于宰后不同時間點用背最長肌測定相關指標，根據汁液流失率大小經聚類分析，將樣品分為高汁液流失率組和低汁液流失率組。

1.3.2 pH值和肉色的測定

采用王娟等[17]的方法，在宰后45 min和24 h分別測定背最長肌的pH值、亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*）。每個樣品測量3 次取平均值。

1.3.3 低場核磁共振測定肌肉中水分分布

在宰后12 h和24 h取背最長肌，參照黃子信等[18]的方法測定，具體操作修改如下：重復掃描次數為8、重復采樣等待時間為3 500 ms、模擬增益為20、數字增益為3、回波個數為2 000、譜寬為100 kHz。油樣預熱儀器30 min后，沿肌纖維方向將肉樣分割成2 cm（長）×1 cm（寬）×1 cm（高）大小的肉樣（約2.0 g），放入核磁小管中并在管口用塑封膜包住，在32 ℃、19 MHz共振頻率下，使用弛豫時間編輯CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈 沖 序 列 （ 9 0 ° 脈 沖 和1 8 0 ° 脈 沖 之 間 的 時 間τ＝200 μs）進行測定，反演得到不同狀態水的相對峰面積比例（相對含量），每個樣品測定3 次，取平均值。

1.3.4 透射電子顯微鏡觀測肌肉微觀結構變化

宰后45 min，3、9、12 h和24 h在背最長肌上切取4 mm（長）×2 mm（寬）×2 mm（高）的肉樣放入體積分數3.5%戊二醛溶液中固定，保藏在4 ℃環境中，用于透射電子顯微鏡觀測。樣品的處理參照Luo Xin等[19]的方法，即在4 ℃環境中，將固定好的各時間點樣品用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）沖洗3 次，每次10 min。之后用體積分數為1%的鋨酸后固定1.5 h，分別用體積分數為50%、70%、80%、90%和100%的乙醇進行逐級脫水，每次15 min。用Epon-618滲透包埋，采用超薄切片機切片，經醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色后用透射電子顯微鏡放大4 000 倍對每個樣品拍攝5 張圖片，使用Image-Pro Plus 5.1軟件測定肌細胞內外間隙的平均距離。

1.3.5 汁液流失率的測定

參照Honikel等[20]的方法測定汁液流失率，并略作修改：宰后24 h，在13肋處切取2.5 cm厚背最長肌一片，稱質量m1，懸于塑料袋中，充氣，肉樣不能和塑料袋接觸，在4 ℃下吊掛24 h，取出稱質量m2，汁液流失率按下式計算。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 19.0軟件計算數據，以平均值±標準誤表示，并進行Duncan多重比較、獨立性T檢驗、Pearson相關性分析和逐步回歸分析。P＜0.05認為具有統計學意義。在進行統計分析之前先對原始數據進行正態性檢驗，根據GB/T 4882—2001《數據的統計處理和解釋正態性檢驗》[21]，只有宰后45 min的肌細胞內間隙不服從正態分布，經lgx轉換后服從正態分布，使用轉換后的值進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 肉樣汁液流失率的聚類分析結果

根據樣品汁液流失率的大小進行聚類分析。如圖1所示，當歐氏距離增至10.5時，將20 個樣品分成高汁液流失率組（n＝10）和低汁液流失率組（n＝10），兩組汁液流失率的范圍分別為5.01%～6.36%和0.57%～3.98%。

圖1 樣品汁液流失率的聚類分析樹狀圖Fig. 1 Dendrogram obtained from cluster analysis of the drip loss rate of pork samples

2.2 兩組肉樣的pH值和肉色比較結果

如表1所示，宰后45 min，低汁液流失率組的pH值極顯著高于高汁液流失率組（P＜0.01），L*值極顯著低于高汁液流失率組（P＜0.01），此結果與何凡等[22]將不同品種羊肉分為不同滴水損失組所測得結果一致。Chmiel等[23]的研究也發現，與正常肉相比，宰后24 h，汁液流失嚴重的PSE肉具有較低的pH值和較高的L*、a*和b*值。綜上，說明高低汁液流失率組之間的pH值和肉色存在一定的差異。

表1 高低汁液流失率組肉樣的肉質指標（n＝ 10）Table 1 Meat quality attributes of pork samples from high and low drip loss rate groups (n= 10)

2.3 低場核磁共振橫向弛豫時間（T2）分析結果

利用低場核磁共振反演計算的各個峰面積比例可以反映樣品中不同狀態水分的比例，峰面積比例變化情況可以表征樣品中不同狀態水分的分布狀態和流動遷移情況[24]。圖2為低場核磁共振測定的T2反演圖譜，出峰位置位于T2b（0.1～10 ms）、T21（10～100 ms）和T22（100～1 000 ms），分別對應結合水、不易流動水和自由水，將3 種狀態水的相對含量分別記為P2b、P21及P22。由于結合水與非水組分結合的牢固程度不同會導致結合水出現2 個信號峰[25]。對于該組分，根據陳琳莉等[25]的方法將兩個峰面積比例疊加后得到結合水相對含量P2b。

圖2 宰后12 h和24 h肉樣的T2弛豫時間分布Fig. 2 Distribution of T2 relaxation time in pork samples at 12 h and 24 h post-mortem

不同狀態水的相對含量如表2所示，在宰后12 h和24 h，結合水相對含量（P2b）在高、低汁液流失率組之間都沒有顯著差異（P＞0.05）；宰后24 h，高汁液流失率組的不易流動水相對含量（P21）極顯著低于低汁液流失率組（P＜0.01），而自由水相對含量（P22）極顯著高于低汁液流失率組（P＜0.01）。這與甄少波等[24]的研究結果一致，表明P21和P22與汁液流失率的關系較為密切，汁液流失率越高的肉，其P22越大，P21越小。

表2 肌肉中3 種狀態水分相對含量的變化Table 2 Changes in relative contents of three water states in muscle at different times post-mortem

2.4 肌細胞內外間隙的變化

從結構上講，肌肉中的汁液流失與排水力（肌原纖維和細胞的收縮）、膜通透性、細胞骨架蛋白降解、汁液流失通道的形成以及蛋白質之間的網絡結構變化有關[4]。Mohan等[26]認為宰后肌肉的僵直會對肌肉的超微結構和品質性狀（特別是質構、嫩度和持水性）產生顯著影響。由于僵直過程中肌原纖維橫向和縱向收縮，水從肌原纖維內轉移到肌漿中，并由細胞膜維持在肌細胞內，使得肌細胞內肌漿空間增大[4,27]。所以在本研究中觀察到肌細胞內外間隙的增加。

如圖3所示，在宰后45 min，低汁液流失率組肉樣肌原纖維結構排列緊密整齊，細胞膜附著在外肌原纖維上，只有輕微的分離（圖3A1）；與此相反，高汁液流失率組肌細胞外間隙比低汁液流失率組大，肌原纖維之間相互分離，膜也呈現大面積分離（圖3A2）；宰后12 h，低汁液流失率組肌細胞外間隙有所增加，肌細胞膜從外肌原纖維上分離（圖3B1），相對于低汁液流失率組，高汁液流失率組肌細胞膜與外肌原纖維呈現更大程度的分離，肌細胞外間隙也更大（圖3B2）；宰后24 h，低汁液流失率組肌細胞膜呈現更大程度的分離，肌細胞外間隙也變得更大（圖3C1），高汁液流失率組肌細胞外間隙相對宰后12 h稍微變小，肌細胞膜依然呈現大面積的分離（圖3C2）。Veiseth-Kent等[28]對宰后13 d的牛肉微觀結構進行觀察也發現肌束膜從肌纖維上脫離，肌纖維間產生空隙。Chmiel等[23]的研究結果表明，宰后24 h正常肉的肌肉組織還保持相對完整，而PSE肉的肌肉組織遭到破壞。說明宰后早期高汁液流失率肉樣比低汁液流失率肉樣的微觀結構變化更明顯。

圖3 宰后45 min（A）、12 h（B）和24 h（C）不同汁液流失率肉樣的透射電子顯微鏡圖Fig. 3 Transmission electron micrographs of muscle samples with different drip loss rate at 45 min (A), 12 h (B) and 24 h (C) post-mortem

為量化宰后豬肉肌細胞超微結構變化，使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 5.1對肌細胞內間隙和肌細胞外間隙進行測量。如表3所示，低汁液流失率組的肌細胞內外間隙在宰后逐漸增大，宰后12 h和24 h沒有顯著差異，但都顯著大于宰后45 min的肌細胞內外間隙（P＜0.05）。高汁液流失率組肌細胞內外間隙宰后的變化不同于低汁液流失率組，高汁液流失率組的肌細胞內間隙在宰后12 h達到最大，而后呈減小趨勢，肌細胞外間隙在宰后12 h達到最大，在宰后24 h顯著減小（P＜0.05）。Sch?fer等[10]的研究也發現肌纖維束之間的空隙面積在3～9 h逐漸增大，在9～24 h減小。可能是由于骨架蛋白降解較快使得肌原纖維間連接遭到破壞產生橫向膨脹[4,11]，導致汁液流失率高的肉肌細胞內外間隙減小。

高汁液流失率組的肌細胞內間隙在宰后45 min顯著大于低汁液流失率組（P＜0.05）。高汁液流失率組的肌細胞外間隙在宰后9 h 顯著大于低汁液流失率組（P＜0.05）。表明宰后高汁液流失率組的肌原纖維收縮更快，形成的空隙更大。這與Hughes等[27]認為汁液流失率高的肉肌原纖維結構收縮更快，細胞外空隙面積更大的觀點一致。較大的空隙會導致肌細胞外毛細管力減弱，使得肌細胞外自由水容易形成汁液流失[29]。采用低場核磁共振觀察到高汁液流失率組的P22高于低汁液流失率組（表2）也證實了這一現象。

表3 兩組肉樣肌細胞內外間隙的差異（n＝10）Table 3 Intra- and extracellular spaces in muscle samples from low and high drip loss groups (n= 10)

2.5 肌細胞內外間隙、不同狀態水分相對含量和汁液流失率間的相關性和回歸分析結果

表4 肌細胞內外間隙、不同狀態水分相對含量和汁液流失率間的相關性分析Table 4 Correlation analysis of intra- and extracellular spaces of myocytes with relative contents of three water states and drip loss rate

魏秀麗等[30]的研究結果表明結合水與不易流動水呈極顯著負相關（P＜0.01），不易流動水與自由水呈極顯著負相關（P＜0.01），不同狀態水之間存在相互“態變”。本研究結果與之相似（表4），在宰后12 h，P2b與P21呈顯著負相關（P＜0.05），P21與P22呈極顯著負相關（P＜0.01）。在宰后24 h，P2b與P22呈顯著負相關（P＜0.05），P21與P22呈極顯著負相關（P＜0.01）。結果表明3 種狀態水確實如魏秀麗等[30]所述，結合水會“態變”為不易流動水，不易流動水與自由水可以發生相互“態變”。

肌細胞內間隙在宰后45 min與宰后12 h和24 h的P21呈顯著負相關（P＜0.05，P＜0.01）（表4）。肌細胞外間隙在宰后45 min與宰后12 h的P21呈顯著負相關（P＜0.05），在宰后9 h與宰后24 h的P21呈顯著負相關（P＜0.05）（表4）。宰后9 h的肌細胞外間隙解釋了宰后24 hP21變異的15.7%（表5），相關系數＝標準偏回歸系數＝-0.449。說明宰后9 h的肌細胞外間隙對宰后24 h的不易流動水影響最大，肌細胞外間隙越大，不易流動水含量越少。

宰后45 min的肌細胞內間隙與宰后12 h和24 h的P22呈極顯著正相關（P＜0.01）（表4），解釋了宰后24 hP22變異的24.8%（表5）。說明在肌細胞內外間隙中，宰后45 min的肌細胞內間隙對P22的直接影響較大，宰后45 min的肌細胞內間隙越大自由水含量越多。

表5 肌細胞內外間隙解釋宰后24 h的P21和P22變異的逐步回歸模型Table 5 Stepwise regression models for explaining variation in P21 and P22with intra- and extracellular spaces of myocytes

肌細胞內間隙在宰后45 min和3 h與汁液流失率呈顯著正相關（P＜0.05，P＜0.01），肌細胞外間隙在宰后9 h與汁液流失率呈顯著正相關（P＜0.05）（表4）。宰后45 min的肌細胞內間隙解釋了汁液流失率變異的45.3%（表6）。說明宰后45 min的肌細胞內間隙對汁液流失率的貢獻較大，且標準偏回歸系數和相關系數都為正，表明宰后45 min的肌細胞內間隙越大，汁液流失率越高。

P2b在宰后12 h和24 h與汁液流失率均沒有顯著相關性（P＞0.05），P21與汁液流失率呈極顯著負相關（P＜0.0 1），P22與汁液流失率呈顯著正相關（P＜0.05，P＜0.01）（表4）。表明結合水與汁液流失率關系不大，不易流動水和自由水會對汁液流失率產生顯著影響，這與王娟[17]、魏心如[31]和Bertram[32-33]等的研究結果一致。繼續將宰后12 h和24 h時3 種狀態水的相對含量與汁液流失率建立逐步回歸模型（表6），結果只有宰后24 h的P22進入模型，解釋了汁液流失率變異的39.5%，標準偏回歸系數達0.655，相關系數為0.646。表明3 種狀態水中自由水對汁液流失率的影響最大，自由水越多，汁液流失率越高。

表6 肌細胞內外間隙和不同狀態水分相對含量解釋汁液流失率變異的逐步回歸模型Table 6 Stepwise regression models for explaining variation in drip loss rate with intra- and extracellular spaces of myocytes and relative contents of different water states

3 結 論

生鮮豬肉在僵直過程中，肌原纖維的收縮會導致肌細胞內和肌細胞外都形成汁液流失通道。高汁液流失率樣品的肌細胞內間隙形成較早，高、低汁液流失率組的肌細胞內間隙在宰后45 min已有明顯差異，而肌細胞外間隙在宰后9 h才有差異。宰后45 min的肌細胞內間隙可以較好地解釋自由水含量和汁液流失率的變異，宰后45 min的肌細胞內間隙越大，后期肌肉中自由水含量越多，汁液流失率越高，持水性越差。