產黃青霉發酵鴨肉制品食用品質、微觀結構及物理化學特性變化

藍天嬋，于 冰，孫京新,*，王淑玲，郭麗萍，王寶維，黃 明，郝小靜，喬昌明

（1.青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.青島農業大學青島特種食品研究院，山東 青島 266109；3.青島農業大學校醫院，山東 青島 266109；4.南京農業大學 國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；5.青島市畜牧獸醫研究所，山東 青島 266100；6.諸城外貿有限責任公司，山東 諸城 262200）

發酵肉制品以其獨特的色、香、味、質地以及營養、健康等特點廣受贊譽[1]。肉類發酵是微生物及其產生的酶與肉類成分（脂類和蛋白質）作用的過程，涉及復雜的物理、化學和感官變化[2-3]。隨著發酵技術和發酵劑研究的不斷深入，除了傳統的發酵火腿和發酵香腸，一些新的發酵加工技術和產品也被應用于食品領域。Geeta等[4]將添加葡萄糖和淀粉并經過植物乳桿菌發酵的雞肉糜制作雞肉香腸，具有很好的抗氧化和抗菌效果。孫京新等[5]通過在滅菌肉塊表面接種微膠囊霉菌發酵劑，克服傳統發酵劑在肉制品發酵過程中發酵期長的缺點，進一步提高發酵肉制品的工業化程度。Chen Qian等[6]用戊糖片球菌、彎曲乳桿菌和木糖葡萄球菌的發酵劑混合物發酵哈爾濱風干腸，以改善風味。陳曦等[7]從貴州酸肉中分離出植物乳桿菌用于香腸的發酵，從而提高了香腸的品質特性。阮一凡等[8]以植物乳桿菌和釀酒酵母菌發酵鴨腿，提升產品口感并延長產品貯藏期。

各種真菌可在肉制品發酵過程中根據其生長優勢產生有益或有害的影響。一些真菌有助于調味、抗氧化和保護作用，而另一些真菌能夠導致腐敗、異味和真菌毒素污染[9]。孫京新等[10]通過紫外線誘變一株原始納地青霉，篩選出經誘變的一株高產蛋白酶納地青霉，并將其應用于發酵畜禽原料糜類餅狀產品，該菌株產蛋白能力強，降解蛋白質程度大，可以顯著改善產品質構。產黃青霉（Penicillium chrysogenum）是一種絲狀真菌，能夠產生青霉素和多種酶類，常用于抗生素生產。在食品和飲料工業中，可從產黃青霉中提取葡萄糖氧化酶，作為安全無毒的防腐劑和穩定劑[11]。在發酵肉制品中，產黃青霉菌作為有益菌種常用于發酵香腸[12]。一般而言，有益菌種為納地青霉和產黃青霉，而赭曲霉和疣狀青霉則是造成霉菌毒素污染的主要原因。例如在產黃青霉接種的香腸中，產黃青霉的生長導致非蛋白氮值和氨基酸分解代謝中的揮發物增加，香氣強度增加，硬度降低[13-14]。目前對鴨肉及鴨肉副產物深加工的研究較少，但都集中在以生肉為原料、以乳酸菌和葡萄球菌為主發酵劑的純菌或者混菌發酵[15-16]，國內外鮮見以產黃青霉為發酵劑發酵熟鴨肉的報道。本實驗將產黃青霉接種于滅菌熟鴨肉中，經過前發酵、后發酵得到產黃青霉發酵鴨肉制品，并對其質地、微觀結構、蛋白質構象、水分分布及揮發性物質進行測定。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

產黃青霉（Penicillium chrysogenum）由中國工業微生物菌種保藏管理中心提供。

新鮮鴨胸肉購自大潤發超市。

戊二醛 汕頭市茂城利發化工有限公司；四氧化鋨北京格林萊特商貿有限公司；叔丁醇、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛 上海譜振生物科技有限公司；Epon-812環氧樹脂北京達昱科儀科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TA-XT2i質構儀 英國Stable Micro Systems公司；7500F掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司；HT7700透射電子顯微鏡 日本日立高新技術公司；HR800顯微激光拉曼光譜儀 法國Jobin-Yvon公司；MR20-025低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）儀上海紐邁電子科技有限公司；7890A-5975C氣相色譜（gas chromatography，GC）-質譜（mass spectrometry，MS）聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 產黃青霉菌懸液的制備

將保藏的產黃青霉菌株接入察氏瓊脂培養基斜面，置于（27±1）℃恒溫培養箱中培養4 d后，連續轉接3 次，獲得活化菌株。將活化好的菌株用適量無菌水洗滌，加入玻璃珠充分振蕩后，用無菌紗布進行過濾，并用無菌水沖洗濾渣3 次，6 000×g離心10 min，獲得孢子懸浮液。將孢子懸浮液進行梯度稀釋，選擇106CFU/mL左右濃度梯度稀釋液作為接種的菌懸液。

1.3.2 發酵鴨肉制品的制備

將鴨胸肉切成3.0 cm×3.0 cm×1.0 cm塊狀，每份取4 塊置于10 cm平皿中。在121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌15 min。將制備好的產黃青霉菌懸液在無菌操作下接種于鴨肉中，每皿接種2 mL菌懸液，空白接種2 mL無菌水，混勻，在（27±1）℃條件下前發酵7 d后，將平皿中的肉塊轉移至質量分數4%氯化鈉溶液中，密封，在30 ℃恒溫條件下后發酵14 d分別得到發酵和對照鴨肉制品。

1.3.3 質構測定

在室溫條件下，用質構儀測定樣品，重復3 次。參照Park等[17]的方法采用二次下壓法測定質構，具體參數如下：探頭型號為P/0.5R柱狀，測試前速率2.0 mm/s、測試速率1.0 mm/s、測試后速率5.0 mm/s、下壓距離8.0 mm、觸發力5.0 g，測定參數為硬度、彈性和黏性。

1.3.4 掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡微觀結構觀察

將對照和發酵鴨肉制品用無菌水洗滌，切成0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm條狀，置于體積分數2.5%戊二醛溶液中，4 ℃固定過夜，用磷酸鹽緩沖液漂洗6 次，每次20 min。再將樣品放入用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制的體積分數1.0%四氧化鋨溶液中，4 ℃固定2 h，然后用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）漂洗6 次，每次10 min；漂洗后的肉樣品依次用體積分數50%、60%、70%、80%和90%的乙醇梯度脫水15 min，無水乙醇脫水3 次，每次30 min；樣品脫水后，用叔丁醇置換3 次，每次30 min；將脫水后的肉樣品進行真空冷凍干燥，用真空離子濺射鍍膜機對肉樣噴金，在掃描電子顯微鏡（電壓為15 kV）下放大1 000 倍觀察。與此同時，將肉樣品在一系列分級的乙醇溶液中脫水，然后包埋在環氧樹脂中。用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行超薄切片染色，自然干燥后在透射電子顯微鏡（電壓為80 kV）下放大5 000 倍觀察。

1.3.5 拉曼光譜測定

如Chen Hongye等[18]的方法所述，將對照和去除產黃青霉菌膜的發酵鴨肉樣品進行拉曼光譜測定，激光器波長為785 nm，功率為100 mW，操作條件：開孔為200 μm，光柵600 g/mm，進行3 次掃描，積分時間為60 s，分辨率為2 cm-1，數據獲取速率為120 cm-1·min-1，獲取的拉曼光譜在300～3 500 cm-1。根據苯丙氨酸環在1 003 cm-1處伸縮振動強度作為內標進行歸一化（強度不隨蛋白質結構變化而變化）[19]。氨基酸側鏈光譜條帶以及肽鍵骨架振動指認通過與文獻報道的多肽和蛋白質拉曼光譜相比對而得到[20-22]。每個樣品進行3 次測試，測試完成后用儀器自帶的Labspec軟件對光譜進行平滑、多點基線校正去除熒光背景。參考Susi等[23]的方法計算蛋白質二級結構（α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲）的相對含量。

1.3.6 LF-NMR測定

稱取對照和去除產黃青霉菌膜的發酵鴨肉樣品各1.5 g，保鮮膜包好后，裝入15 mm的核磁管，而后放入LF-NMR儀，用CPMG脈沖序列進行橫向馳豫時間（T2）的測試，使用SIRT算法進行1 000 000 次迭代擬合[24]。所使用的參數為：90°脈寬為4.5 μs、180°脈寬為9 μs、采樣頻率為200 kHz、開始采樣時間為20 μs、等待時間為5 000 ms、模擬增益為20、數字增益為3、累加采樣為4、回波時間為300 μs、回波個數為6 000 個，重復掃描8 次。

1.3.7 GC-MS測定

將對照和去除產黃青霉菌膜的發酵鴨肉樣品分別在室溫下剪碎至黃豆粒大小，各取5 g于固相微萃取瓶中，萃取頭在GC進樣口老化60 min（280 ℃）后插入瓶中頂空部分，在60 ℃條件下萃取60 min，吸附結束后，拔出萃取頭，再于GC進樣口250 ℃下解吸2 min。

G C-M S 條件：采用T R-5-M S 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至200 ℃，再以10 ℃/min升溫至240 ℃，保留10 min，運行總時間為49 min、檢測溫度240 ℃、載氣為He、流速為1.6 mL/min、恒壓13.02 kPa、離子源溫度240 ℃、電子能量70 eV?；衔锝涍^計算機檢索同時與NIST Library、Wiley Library、Mainlib數據庫匹配。匹配度和反匹配度大于600（最大值1 000）的作為定性結果。采用相對含量按峰面積歸一化法處理，進行揮發性物質定量分析。

1.3.8 感官評定

將對照和去除產黃青霉菌膜的發酵鴨肉樣品切成均勻的薄塊，由8 名有經驗的人員分別從色澤、香氣、滋味和組織形態4 個方面對樣品進行感官評定，分值標準見表1，每項指標的權重分別記為X1、X2、X3、X4，總分X＝0.15X1+0.35X2+0.35X3+0.15X4。

表1 鴨肉制品感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented duck meat

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 19.0軟件中的ANOVA法進行方差分析，并用Duncan’s多重比較，差異顯著性水平為P＜0.05。運用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 質構特性測定結果

圖1 發酵過程中鴨肉樣品硬度變化Fig. 1 Changes in hardness of duck meat during fermentation

圖2 發酵過程中鴨肉樣品彈性變化Fig. 2 Changes in springiness of duck meat during fermentation

硬度能夠衡量成熟程度，與肉蛋白的變性、水解以及水分損失有關[25]。從前發酵7 d開始，產黃青霉發酵鴨肉硬度比對照組（未發酵鴨肉）明顯降低（圖1）。從后發酵5 d開始，產黃青霉發酵鴨肉彈性比對照組明顯降低（圖2）。本研究中樣品隨著發酵過程中蛋白質水解程度的增加，產生大量水溶性物質，蛋白質的網狀結構被破壞，樣品硬度和彈性呈現下降趨勢。Kargozari等[26]報道的4 種配方發酵香腸在成熟過程中彈性變化與本研究類似。除后發酵1 d外，產黃青霉發酵鴨肉比對照組黏性明顯增加（圖3）。Laranjo等[27]表明，在干發酵香腸發酵前期，黏性隨發酵時間延長而增大。在前發酵時期，黏性先增大后減小，這與產黃青霉的生長繁殖有關。前發酵1～4 d產黃青霉生長旺盛，菌絲體分泌物增多，高水分含量導致樣品表面黏性增大；前發酵5～7 d產黃青霉進入生長穩定期，大量消耗水分導致樣品失水，黏性減小。劉功明等[28]用納地青霉發酵滅菌雞肉，發現雞肉制品的硬度和彈性顯著降低，黏性顯著增加。

圖3 發酵過程中鴨肉樣品黏性變化Fig. 3 Changes in gumminess of duck meat during fermentation

2.2 掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察結果

圖4 對照組（A）與產黃青霉發酵鴨肉制品（B）掃描電子顯微鏡圖（×1 000）Fig. 4 SEM micrographs of control (A) and fermented duck meat (B) (×1 000)

由圖4可知，對照組經過滅菌（121 ℃、0.1 MPa）處理后，肌纖維及其中的肌原纖維結構較完整，排列較整齊；產黃青霉發酵鴨肉制品中已無完整肌纖維結構，表面微觀結構均為顆粒狀，無序排列、相互黏連，呈糜狀。Fadda等[29]利用植物乳桿菌提高發酵肉產酸過程證明了發酵肉結構變化與蛋白分解有關。

圖5 對照組（A）與產黃青霉發酵鴨肉制品（B）透射電子顯微鏡圖（×5 000）Fig. 5 TEM micrographs of control (A) and fermented duck meat (B) (× 5 000)

由圖5可知，對照組肌原纖維排列緊密，肌節保持完整；產黃青霉發酵鴨肉制品無肌原纖維結構，肌節斷裂為碎片狀，無規則排列，且碎片間空隙明顯。Katsaras等[30]通過透射電子顯微鏡同樣發現發酵香腸的肌原纖維斷裂，降解成細絲狀或成絮狀凝結。肌原纖維結構微觀結構變化也可以解釋發酵鴨肉制品硬度和彈性降低、黏性增大與產黃青霉作用密切相關。

2.3 拉曼光譜分析結果

2.3.1 蛋白質二級結構

蛋白質的二級結構包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲等。拉曼光譜圖中，酰胺I帶和酰胺III帶極少受到其他分子群的干擾，具有較強的拉曼效應，所以一般將酰胺I帶和酰胺III帶作為分析鑒定蛋白質二級結構的可靠模型[31]。如圖6所示，拉曼光譜中酰胺I帶的范圍為1 600～1 700 cm-1，其中，1 645～1 657 cm-1是高α-螺旋含量的蛋白質在拉曼光譜上吸收峰所在的區域；以β-折疊結構為主的條帶位于1 665～1 680 cm-1；1 680 cm-1為β-轉角含量高的蛋白質吸收峰所在區域；無規卷曲結構在1 660～1 665 cm-1范圍內。在酰胺III帶的范圍中，表征不同結構的譜帶有部分重合的區域，高α-螺旋含量的蛋白質主要在1 260～1 300 cm-1，與β-轉角存在重合區域；β-折疊在1 238～1 245 cm-1；無規卷曲結構出現在1 250 cm-1[32]。

圖6 對照組（A）與產黃青霉發酵鴨肉制品（B）蛋白質拉曼光譜Fig. 6 Raman spectra of control (A) and fermented duck meat (B)

產黃青霉發酵鴨肉制品蛋白質二級結構相對含量如圖7所示，其中α-螺旋相對含量由57.01%降低到44.28%，β-折疊相對含量由17.65%增加到26.31%；β-轉角和無規卷曲相對含量變化不明顯。α-螺旋相對含量的降低和β-折疊相對含量的增加與肌肉蛋白的變化密切相關[33]。鴨肉經過產黃青霉發酵，蛋白質的網狀結構被破壞，一些暴露的疏水性基團導致α-螺旋相對含量降低，從而使得產黃青霉發酵鴨肉制品硬度和彈性降低。Guo Liping等[34]用婁地青霉發酵雞肉，雞肉制品中α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加，雞肉硬度和彈性降低。

圖7 鴨肉制品蛋白質二級結構相對含量Fig. 7 Secondary structure relative contents of proteins in duck meat

2.3.2 蛋白質三級結構

苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸顯示出高疏水性，在維持蛋白質分子網狀結構的穩定性方面起著重要作用。當蛋白質發生降解時，蛋白質分子結構會變得疏松，埋藏在蛋白質分子內部的疏水性氨基酸暴露于溶劑中，使得蛋白質非極性增強、極性減弱，從而增強了疏水性[35]。

較高強度比（I760cm-1/I1003cm-1）的色氨酸殘基表示疏水環境，隨著強度比的降低，色氨酸殘基由疏水環境變成親水環境。酪氨酸殘基強度比（I850cm-1/I830cm-1）用于確定酪氨酸殘基是否被掩埋，I850cm-1低于I830cm-1時，表示酪氨酸殘基被掩埋在疏水環境中[36]。因此，色氨酸殘基微環境均一化強度（I760cm-1/I1003cm-1）越大，疏水性越強；酪氨酸殘基微環境均一化強度（I850cm-1/I830cm-1）越小，疏水性越強。表2為產黃青霉發酵鴨肉制品蛋白質色氨酸殘基和酪氨酸殘基微環境變化。與對照組相比，產黃青霉發酵鴨肉制品蛋白質色氨酸殘基微環境均一化強度（I760cm-1/I1003cm-1）由0.647顯著升高到0.740（P＜0.0 5），酪氨酸殘基微環境均一化強度（I850cm-1/I830cm-1）由0.981顯著降低到0.844（P＜0.05），這表明蛋白質疏水性基團暴露，其疏水性增強[37]。

表2 鴨肉制品蛋白質色氨酸殘基（I760 cm－1/I1 003 cm－1）和酪氨酸（I850 cm－1/I830 cm－1）殘基微環境均一化強度Table 2 Normalized intensity of microenvironment for tryptophan (I760 cm－1/I1 003 cm－1)and tyrosine (I850 cm－1/I830 cm－1) residues of proteins in duck meat

2.4 LF-NMR測定結果

圖8 鴨肉制品橫向弛豫時間（T2）分布圖譜Fig. 8 Distribution of transverse relaxation time (T2) of duck meat

圖8 為產黃青霉發酵鴨肉制品的LF-NMR橫向弛豫時間（T2）分布圖譜，表3、4分別為3 種狀態水分對應橫向弛豫時間T20、T21、T22分布和對應積分面積P20、P21、P22分布。T20（1～10 ms）代表結合水；T21（10～100 ms）代表不易流動水；T22（100～1 000 ms）代表自由水[38-39]。P20、P21、P22分別代表3 種狀態水分的相對含量。與對照組相比，產黃青霉發酵鴨肉制品橫向弛豫時間T20由1.28 ms顯著增加到1.76 ms（P＜0.05），P20由0.77顯著減小到0.68（P＜0.05），這表明結合水相對含量顯著降低（P＜0.05）；T21由19.82 ms顯著增加到34.95 ms（P＜0.05），P21由99.20顯著減小到96.60（P＜0.05），可知不易流動水相對含量顯著降低（P＜0.05）。水分分布變化是發酵肉制品的主要質量指標，參與了微生物生長和酶解反應，影響產品的感官品質[40]。因此，經過后發酵，最終鴨肉制品中自由水相對含量增加，表面比較濕潤，賦予鴨肉良好的口感。

表3 鴨肉制品中3 種狀態水分對應橫向弛豫時間T20、T21、T22分布Table 3 Transverse relaxation times T20, T21, and T22 in duck meat

表4 鴨肉制品中3 種狀態水分對應積分面積P20、P21、P22分布Table 4 Peak integral areas of three water components P20, P21 and P22 in duck meat

2.5 GC-MS分析結果

表5 鴨肉制品揮發性物質Table 5 Volatile compounds identified in duck meat

續表5

如表5所示，與對照組相比，產黃青霉發酵鴨肉制品揮發性物質在種類上有所增加。對照組中檢測到揮發性

物質29 種，其中，醛類2 種、烴類26 種、醇類1 種；產黃青霉發酵鴨肉制品中檢測到揮發性物質48 種，其中，醛類6 種，烴類28 種，醇類7 種，新產生的揮發性物質有酮類（3-羥基-2-丁酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮）2 種、酯類（亞硫酸-丁基癸酯）1 種和酸類（乙酸、丁酸、己酸、辛酸）4 種。產黃青霉在肉制品發酵中，通過發達的酶系分解蛋白質、脂肪，產生小分子肽和脂肪酸，形成揮發性物質的前體。醛類是重要的中間體，能夠參與氨基酸和羰基化合物的相互作用[41]。與對照相比，產黃青霉發酵鴨肉制品醛類增加了4 種（正己醛、庚醛、正辛醛、苯甲醛）。劉功明等[42]用納地青霉發酵滅菌鴨肉，與未發酵鴨肉相比，納地青霉發酵鴨肉制品中醇類、醛類及芳香族類物質的含量有所增加，形成了良好的風味。

2.6 感官評定結果

表6 鴨肉制品感官評定結果Table 6 Sensory evaluation results of duck meat

由表6可知，產黃青霉發酵鴨肉制品的感官評分顯著高于對照組（P＜0.05）。鴨肉經過產黃青霉發酵，肌原纖維被破壞，硬度和彈性明顯降低，黏性明顯增加。從而使產黃青霉發酵鴨肉制品質地軟而松散、表面多汁，具有良好的感官品質。

3 結 論

產黃青霉發酵鴨肉及其制品與對照組相比，在質地、微觀結構、蛋白質構象、水分分布和揮發性物質種類等方面發生了適于食用的品質變化。產黃青霉發酵鴨肉制品的微觀結構表明，鴨肉無完整肌原纖維；產黃青霉發酵鴨肉制品的硬度和彈性明顯降低，黏性明顯增加；熟鴨肉經過產黃青霉發酵，在蛋白質構象方面，α-螺旋相對含量明顯減少、β-折疊相對含量明顯增加，疏水性顯著增強（P＜0.05）；在水分分布方面，結合水和不易流動水相對含量顯著降低（P＜0.05）；此外，產黃青霉發酵鴨肉制品揮發性物質種類增加，新產生的揮發性物質包括酮類、酯類和酸類。因此，產黃青霉有潛力作為發酵劑用于生產特定風味和質地的新型即食發酵肉制品，這為開發可安全食用的發酵鴨肉制品提供了一種新思路。