南極磷蝦肽促進小鼠骨折愈合作用及其機制

李 卓，田迎櫻，李雪靜，于 朋，王靜鳳,*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.青島海洋生物醫藥研究院，山東 青島 266000）

骨折是由外力作用、骨骼疾病等引起的骨或骨小梁的連續性中斷，容易造成骨折延遲愈合或不愈合的現象。有統計數據顯示，長骨開放性骨折后，17%的患者出現骨不連現象，另有8%患者的骨骼出現延遲愈合，嚴重影響患者健康及日常生活[1]。骨折延遲愈合引起的高致殘率與I型糖尿病、中風或獲得性免疫缺陷征對患者產生的影響相當[2]。目前還沒有被批準的藥物用于加速骨折愈合或治療骨不連[3]。臨床上常采用物理和基因治療的方法治療骨折，但是這些方法價格昂貴，也有可能出現副作用，所以人們期望采取膳食治療的方法輔助臨床治療，加快患者骨折愈合速度；因此，通過膳食治療來加快骨折愈合逐漸成為研究熱點。

南極磷蝦資源開發應用前景廣闊，除蘊藏量豐富之外，南極磷蝦還具有高營養價值，被譽為巨大的蛋白質庫[4]。有研究表明，相比陸生生物體內提取難度大且含量極低的生物活性肽，南極磷蝦蛋白是一類生物價優于肉類蛋白和牛奶蛋白的優質蛋白[5]。隨著生物活性肽的高效利用在營養和食品科學領域中逐漸受到關注，通過酶解手段制備具有生物活性的南極磷蝦多肽，可進一步擴展南極磷蝦資源的開發利用空間[6]。有文獻表明南極磷蝦肽（peptides from Antarctic krill，AKP）具有抗疲勞[7]、抗氧化[8]、降血壓[9]等活性，本課題組前期研究發現，經酶解產生的低氟AKP[10]和磷酸化磷蝦肽[11]可以有效調節去卵巢大鼠體內的骨穩態，且能通過激活BMP2/Smads和Wnt/β-catenin分子途徑促進骨形成[12]，改善老年性骨質疏松癥，而骨形成對橋接愈傷組織的穩定性至關重要，但有關AKP調節骨折愈合及其機制的研究尚鮮見報道。本實驗以AKP為研究對象，研究其對小鼠骨折愈合過程的促進作用及相關機制，以期為南極磷蝦蛋白的高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雌 性C 5 7 B L / 6 小 鼠 （ S P F 級 別 ， 體 質 量（20.00±2.50）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2014-0001。

脫脂南極磷蝦粉購于遼寧省大連海洋漁業集團。

蛋白聚糖Aggrecan、轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、I型膠原蛋白（collagen type I，Col1α）、酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 美國R&D公司；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒、隨機引物 上海生工生物技術服務有限公司；M-MLV逆轉錄酶 美國Promega公司；dNTP Mixture 寶日醫生物技術（北京）有限公司；成軟骨分化轉錄因子（SRY-related HMG-box，SOX9）、X型膠原蛋白（collagen type X，Col10α）、TGF-β等檢測基因引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

GL-20M高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器公司；1200型液相色譜儀、10/300 GL色譜柱 美國Agilent Technologies公司；HZ-TQG-10L低溫噴霧干燥機 上海雅程儀器公司；Model 680型酶標儀美國Bio-Rad公司；微型電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）系統 瑞士Scanco Medical AG公司；WGP-300型隔水式恒溫培育箱 上海安亭科學儀器有限公司；BH-2型顯微鏡 日本Olympus公司；Ultra Trurrax T18 basic型高速勻漿機 德國IKA公司；Light Cycler 96 Instrument實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 AKP的制備

參照薛長湖等[13]的方法制備AKP。將脫脂南極磷蝦粉與水按1∶10（m/V）配成均勻溶液（pH 7.5），按1∶50（m/V）加入中性蛋白酶，50 ℃酶解6 h，100 ℃水浴使酶失活，酶解反應終止，4 500 r/min離心20 min取上清液。0.3 mol/L鹽酸清洗脫氟，靜置后4 500 r/min離心20 min取上清液，經噴霧干燥即得AKP。凝膠排阻色譜法測得AKP分子質量主要分布在400～2 000 Da，凝膠色譜條件：流動相為體積分數30%乙腈（0.1%三氟乙酸），樣品質量濃度為5 g/L，進樣量為50 μL，流速為0.5 mL/min，紫外檢測波長為220 nm；參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定 凱氏定氮法》測定AKP中蛋白質量分數為85.4%；參照李紅艷[14]的方法采用氟離子選擇電極法測得AKP中氟含量為1.66 mg/kg。

1.3.2 動物分組及骨折模型建立

70 只健康小鼠適應性飼養一周后，體積分數4%水合氯醛麻醉，于右脛中上1/3處進行脛骨開放性骨折手術。術后存活小鼠隨機分為：骨折模型組（Model，生理鹽水）、AKP低劑量組（AKP-L，200 mg/kg mb）、AKP高劑量組（AKP-H，400 mg/kg mb），每組21 只。骨折術后第一天立即灌胃受試動物，每天一次，灌胃量均為10 mL/kgmb。分別在術后5、10、21 d，每組取7 只小鼠禁食不禁水8 h后摘眼球取血，分離血清用于相關指標的測定，取3 只右脛骨痂，快速剔除肌肉和筋膜組織用于組織形態學觀察，取剩余4 只右脛骨痂于-80 ℃保存，用于測定軟骨內骨化過程關鍵基因mRNA的轉錄水平。

1.3.3 骨痂組織形態學觀察

取5、10、21 d小鼠右脛骨痂，置于體積分數10%中性甲醛中固定24 h，于體積分數8%乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH 7.3）中脫鈣3～4 周，每隔一周更換一次脫鈣液。脫鈣完成后，常規石蠟包埋切片（厚7 μm），進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，顯微鏡監測骨痂組織形態變化過程。

1.3.4 CT分析

骨折術后21 d，取下髓內針，用微型CT系統以70 kV的電壓和114 μA的電流掃描小鼠右脛骨，掃描區域為骨折線近端3 mm和遠端3 mm之間。使用匹配軟件中的骨骼分析庫功能計算形態參數（骨小梁數、骨體積/組織體積和骨小梁間距），用Image J軟件分析2D CT圖像獲得骨痂組織橫切面，直接測量最長直徑（a）和最短直徑（b）以評估愈傷組織的尺寸。

1.3.5 血清生化指標測定

參照ELISA試劑盒說明書檢測不同時期小鼠血清Aggrecan、TGF-β、VEGF、Col1α的質量濃度。

1.3.6 qPCR分析

取5、10、21 d小鼠右脛骨痂，按照總RNA抽提試劑盒說明書進行總RNA提取，每個樣本取1 μg RNA逆轉錄為cDNA，參照qPCR Mastermix說明書添加各反應物，在25 μL反應體系中進行qPCR擴增。所用目的基因引物序列見表1，以β-actin作為內參校正。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time polymerase chain reaction of different genes

1.4 數據處理與分析

所有數據均以平均值±標準差表示，使用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，采用最小顯著性差異法進行組間比較，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 AKP對軟骨性骨痂形成的影響

圖1 術后5 d骨痂組織切片HE染色（10×、20×）Fig. 1 Hematoxylin-eosin (HE) staining of the callus on day 5 post-surgery (10 ×, 20 ×)

如圖1所示，骨折術后5 d，模型組骨折斷裂端間隙大，只有少許炎性細胞及未分化的間充質細胞，斷裂處尚未形成纖維骨痂。與模型組相比，灌胃AKP后，低劑量組骨折斷裂處的炎性細胞及間充質細胞數量明顯增多，有利于纖維骨痂的形成；高劑量組能夠更快地度過炎癥期，血腫更快演變成纖維結締組織，使兩個斷裂端初步連接在一起，并已出現少許成熟的軟骨細胞，有利于軟骨性骨痂的形成，且效果明顯優于低劑量組。

2.2 AKP對軟骨性骨痂向骨性骨痂轉變的影響

圖2 術后10 d骨痂組織切片HE染色（10×、20×）Fig. 2 HE staining of the callus on day 10 post-surgery (10 ×, 20 ×)

如圖2所示，骨折術后10 d，各組均處在軟骨痂期。模型組的軟骨細胞大多為未成熟且排列緊密的幼稚軟骨細胞，尚未出現成熟肥大、礦化的軟骨細胞。灌胃AKP后，低劑量組骨折周圍軟骨細胞多為成熟的肥大軟骨細胞，且出現少量礦化新骨；高劑量組軟骨細胞面積明顯減少，且有大量骨小梁及新生血管出現，礦化凋亡更明顯。本實驗發現，AKP的干預以劑量依賴性的方式促進軟骨性骨痂向骨性骨痂轉變，在術后中期（10 d）能不同程度地促進軟骨細胞的肥大礦化和骨折愈合。

2.3 AKP對板層骨的形成及硬骨痂重塑的影響

骨折術后21 d，各組均處在硬骨痂期，此時模型組的骨痂為松散的編織骨，排列不規則，骨細胞數量多、體積大、不成熟（圖3A1）；灌胃AKP后，低劑量組編織骨面積明顯增加，形成了更密集的骨組織（圖3A2）；高劑量組的骨細胞趨于成熟，體積小、數量少，能形成更致密、更厚實的骨組織，并已經向板層骨轉化（圖3A3），AKP的干預可以在骨折后期（21 d）促進新骨生成并由編織骨向板層骨轉化。

圖3 術后21 d骨痂組織切片HE染色（A）、骨痂3D微結構（B）及骨骼形態參數（C）分析圖Fig. 3 HE staining (A), 3D micro-CT testing (B) and morphological parameter (C) analysis of the callus on day 21 post-surgery

為進一步觀察硬骨痂骨量和微結構的變化，對骨折術后21 d的骨痂進行了三維掃描。結果如圖3B所示，模型組愈合緩慢，小梁骨骨質稀疏，且皮質骨尚未形成完整的結構。低、高劑量組骨痂形態更好，皮質骨更光滑。相比于模型組，低劑量組的骨體積/組織體積和骨小梁數分別極顯著增加了12.54%和18.00%（P＜0.01），骨小梁間距顯著減少了14.29%（P＜0.05）；高劑量組的骨體積/組織體積和骨小梁數分別極顯著增加了45.44%和22.10%（P＜0.01），骨小梁間距極顯著減少了17.31%（P＜0.01），高劑量AKP干預生成的骨體積/組織體積更大，骨小梁間距更低（圖3C），即AKP干預可顯著促進骨痂重塑（P＜0.05）。

CT掃描結果見圖4，實驗結果顯示了骨痂的成熟度（圖4A），即骨痂的白色越深表明骨痂的礦化越明顯，即AKP具有劑量依賴效應地促進骨痂礦化。此外，AKP干預能顯著減小骨痂尺寸（圖4B），與模型組相比，低、高劑量組骨痂截面的最長直徑分別極顯著減少了12.85%、37.56%，最短直徑分別極顯著減少了16.27%、38.28%（P＜0.01）。

圖4 術后21 d骨痂二維掃描分析（A）及骨痂尺寸（B）Fig. 4 Micro-CT testing (A) and size (B) of the callus on day 21 post-surgery

2.4 AKP對骨折愈合血清指標的影響

Aggrecan標志著軟骨基質的形成；TGF-β是轉化生長因子超家族中的一員，在軟骨形成過程中具有促進軟骨細胞分化和成熟的作用[15]。骨折術后第10天，與模型組相比，AKP干預顯著降低了血清Aggrecan質量濃度（P＜0.05），低、高劑量組分別降低了15.68%、16.22%（圖5A）；血清TGF-β的質量濃度極顯著升高（P＜0.01），低、高劑量組分別升高了5.69%、10.45%（圖5B）。說明AKP的干預有促進軟骨基質合成、軟骨細胞分化成熟的作用，使其提前度過軟骨基質合成高峰期，向軟骨細胞成熟與礦化邁進。

VEGF是血管生成誘導因子，Col1α是新骨生成的標志[16]。各組VEGF質量濃度均在術后第10天達到最高水平；術后第21天，高劑量組血清VEGF質量濃度較模型組極顯著降低了21.45%（P＜0.01）（圖5C），同時高劑量組中Col1α質量濃度較模型組極顯著增加了15.5%（P＜0.01）（圖5D），表明AKP在愈合中后期較模型組可更早地進行血管重建從而促新骨生成，且高劑量AKP效果優于低劑量AKP。

圖5 AKP對骨折愈合過程中血清生化指標的影響Fig. 5 Effect of AKP on serum biochemical indicators

2.5 AKP對軟骨內成骨過程關鍵基因轉錄的影響

SOX9是軟骨細胞形成早期重要的轉錄因子，Col10α是軟骨細胞肥大分化的標志，二者轉錄水平的提高可刺激增殖或使預肥大的軟骨細胞轉化成肥大軟骨細胞[17]。由圖6可知，與模型組相比，骨折術后第5天，高劑量組SOX9的mRNA相對表達水平極顯著提高了94.34%（P＜0.01）；骨折術后第10天，低、高劑量組SOX9的mRNA相對表達水平分別顯著提高了28.73%、142.62%（P＜0.05，P＜0.01），Col10α相對表達水平分別極顯著提高了84.37%、146.8%（P＜0.01）；骨折術后第21天，低、高劑量組SOX9的mRNA相對表達水平分別顯著降低了23.15%、45.37%（P＜0.05，P＜0.01），Col10α相對表達水平分別極顯著降低了83.3%、88.5%（P＜0.01），具有劑量依賴效應。說明低、高劑量組的軟骨形成進程均不同程度地領先于模型組，顯著加快了軟骨細胞的肥大和成熟，從而加快軟骨內成骨進程。

圖6 AKP對軟骨形成及肥大相關因子mRNA表達的影響Fig. 6 Effect of AKP on mRNA transcription of cartilage formation-related factors

圖7 AKP對基質降解及血管生成標志物mRNA轉錄的影響Fig. 7 Effect of AKP on mRNA transcription of cartilage degradation and angiogenesis biomarkers

基質降解與血管入侵是軟骨內骨化過程的關鍵步驟。基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP13）是軟骨基質降解的標志性酶，促血管生成素1（angiopoietin 1，Ang1）是近年來發現的血管再生誘導因子，VEGF能夠促進內皮細胞增殖和血管生成，是強有力的血管再生因子[18-19]。由圖7可知，模型組MMP13、VEGFmRNA轉錄水平均在骨折術后第21天達到高峰，提示模型組基質降解及血管生成速率較慢，骨折愈合進程滯后。而經AKP的干預在第10天可提高MMP13、Ang1、VEGFmRNA轉錄水平，其中高劑量組效果更顯著，較模型組分別極顯著提高了57.71%、34.69%和57.46%（P＜0.01），而在第21天MMP13、Ang1、VEGFmRNA轉錄水平顯著下調。說明AKP干預后較模型組顯著加快了軟骨基質的降解及新血管的生成，從而加速軟骨內骨化進程。

TGF-β能誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，刺激成骨細胞的增殖以及細胞外基質（II型膠原、骨橋蛋白、I型膠原）的合成，Col1α和OCN是新骨生成的標志基因[20]。由圖8可知，骨折術后第10天，AKP的干預可以提高TGF-β、Col1α和OCNmRNA的轉錄水平，且總體上高劑量組效果優于低劑量組。提示模型組新骨生成進程滯后，而AKP的攝入可以劑量依賴性地加快新骨生成速率，促進骨折愈合。

圖8 AKP對骨形成相關因子mRNA轉錄的影響Fig. 8 Effect of AKP on mRNA transcription of bone formation-related factors

3 討 論

本實驗采用右脛開放性骨折模型，評估不同劑量AKP干預對小鼠骨折愈合過程的影響。結果發現，灌胃AKP可顯著加快骨折愈合早、中期成軟骨分化、軟骨增殖和肥大以及愈合后期的血管入侵、新骨形成，即AKP通過加速軟骨內骨化過程，促進小鼠骨折愈合。

骨折的愈合是骨的再生長過程，成骨過程包括膜內成骨和軟骨內成骨兩種方式[21]，其中軟骨內成骨在長骨骨折愈合中起著重要作用[22]。軟骨內成骨修復過程中，早期形成的軟骨細胞需經歷增殖、分化、肥大凋亡過程，隨后無血管的軟骨組織通過軟骨基質降解和血管侵襲轉變為血管豐富的骨組織[23-24]，實現由軟骨性骨痂向硬骨性骨痂的轉變，重建骨折間隙，進而達到促進骨折愈合。

SOX9屬于成軟骨細胞分化因子，是促進軟骨細胞發生和分化的重要轉錄因子[25]。Kostenuik等[26]證明在骨折愈傷組織中，與單純刺激成骨相比，較好的軟骨組織的形成對促進骨折愈合十分有效。Murao等[27]發現，骨折誘導的SOX9陽性軟骨祖細胞能夠在骨折修復過程中分化為成骨細胞和骨細胞，從而直接進行骨折修復，加快骨折愈合。有研究表明，在軟骨形成過程中，TGF-β可以誘導纖維連接蛋白和軟骨細胞外基質的形成[28]，不僅可以活化骨祖細胞、刺激其增殖并向成骨細胞分化，還能誘導軟骨的形成及分化[29]。本實驗結果顯示，AKP的干預可以劑量依賴性地上調愈合早、中期SOX9與TGF-β的mRNA轉錄水平，組織學染色結果也表明其能促進骨折早期軟骨組織的形成從而加快骨折愈合。

軟骨細胞肥大后，一般會伴隨著軟骨基質的降解和血管的侵入，進而為骨組織的形成釋放更大的空間[30]。血管生成是骨折愈合的重要組成部分，骨折部位血管生成不良常會導致骨折愈合延遲，其中Ang1屬于血管再生誘導因子，缺氧誘導因子-1α介導的VEGF表達是血管生成的關鍵因素。有研究表明，人臍帶間充質干細胞分泌的外泌體（uMSC-Exos）是通過調節VEGF的表達而發揮促進骨再生的作用[31]，這也側面印證了血管生成對骨折修復的重要作用。本實驗發現，高劑量AKP的干預對骨折中期血清VEGF質量濃度及mRNA的轉錄均有顯著的促進作用，血清VEGF的質量濃度與mRNA轉錄水平隨時間的延長而變化，均在骨折術后11 d達到頂峰隨后下降，提示AKP干預較模型組能夠促進血管入侵，充足的血液供給能為骨折愈合提供多種細胞因子。

OCN與Col1α水平可以直觀反映骨形成的速率，通常臨床上認為，當骨痂不斷鈣化并加強，形成能夠抵抗肌肉收縮及旋轉力的橋接骨痂時則視為臨床愈合，而這個過程中新骨的形成扮演著重要角色[32]。AKP的干預不同程度地提高血清Col1α質量濃度及mRNA轉錄水平，同時OCN的mRNA轉錄水平也顯著提高，這與組織學染色結果中的硬骨痂形成及愈合程度相對應。CT結果也表明AKP的攝入可以劑量依賴性地改善骨微結構，顯著提高骨體積/組織體積、骨小梁數目，降低骨小梁間距。提示AKP的干預能夠促進骨痂礦化及骨重塑過程。

蛋白質對正常骨生長至關重要，已有研究表明高蛋白飲食可以增加胰島素樣生長因子-1的分泌[33]，同時胰島素樣生長因子-1已被證實是軟骨細胞分化的關鍵調節因子[34]。牛乳蛋白中篩選出的具有骨保護作用的生物活性肽[35]和酪蛋白磷酸肽，在體外和體內水平上都被證實具有促進腸道鈣吸收的作用[36-37]。鮭魚皮明膠水解物也被證明能夠促進hFOB 1.19（人SV40轉染成骨細胞）的增殖[38]。Hou Tao等[39]研究表明，攝入脫鹽的鴨蛋清肽后，可在體內與鈣結合形成可溶的螯合物，被腸細胞吸收為小肽，同時與瞬時受體電位類香草酸6鈣通道的相互作用來調節腸細胞的增殖和分化，促進腸鈣的吸收從而調節骨代謝。

綜上，AKP能通過促進軟骨形成及其肥大、促進軟骨基質降解、血管入侵以及后期新骨生成來促進軟骨內成骨進程，從而加速正常生長的開放性骨折模型小鼠的骨折愈合。