紫花蕓豆抗性淀粉對高脂血癥大鼠肝臟及腸屏障損傷的修復作用

劉淑婷，王 穎,2,3,*，王志輝,2，王 迪，張艷莉，佐兆杭，王浩宇，鄧 薇

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室，黑龍江 大慶 163319）

隨著消費者生活方式和膳食結構改變，高脂血癥患病率逐年攀升。大量數據表明，中國成年人高脂血癥患病率高達18.6%[1-2]。高脂血癥是心腦血管疾病如動脈粥樣硬化、缺血/溢血性中風等病癥的重要發病因素[3]。高脂血癥是指由體內血脂代謝紊亂引發血脂異常的一類代謝綜合類疾病統稱，而肝臟作為身體代謝的重要器官，在調節機體能量平衡方面起關鍵作用[4-6]。當人體攝入和消耗的能量不平衡時，脂肪組織中過量的游離脂肪酸會將脂肪聚集在肝細胞中，使肝臟組織病變形成肝硬化、脂肪肝等病癥[7]。同時，高脂血癥誘發機體自由基蓄積、免疫功能紊亂、腸道菌群失調，進而損傷腸道功能。現階段針對高脂血癥及其并發癥的傳統方法一般采取多種降脂藥物聯合干預的方式，其成本高昂、毒副作用大[8-9]。因此，探尋一種可通過膳食補充降低血液中甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）含量，有效改善高脂血癥的天然產物具有重要意義。

抗性淀粉是指在健康人體小腸中不被吸收，但在結腸中能被微生物完全或部分利用發酵產生對人體有益的短鏈脂肪酸的淀粉及其降解物，具有降低餐后血糖濃度、控制體質量、改善腸道健康等生理功能[10-11]。目前，對抗性淀粉生理功能的研究主要集中在其參與糖代謝、調節腸道菌群、預防結腸癌等方面，在脂質代謝方面的研究則更偏向于高直鏈玉米來源的抗性淀粉，Polakof等[7]研究發現Hi-Maize 260玉米抗性淀粉能有效改善高脂血癥大鼠胰島素抵抗造成的肝臟損傷。而對于雜糧豆類抗性淀粉的降脂護肝功能，尤其是對高脂造成的腸屏障損傷修復方面研究報道較少。蕓豆，作為小宗雜糧豆類，具有極高的食用和藥用價值。本實驗以墾區主產紫花蕓豆為原材料制備抗性淀粉，以高脂血癥大鼠模型為對象，研究蕓豆抗性淀粉對血脂異常導致的肝臟和腸屏障損傷的修復作用，旨在拓寬蕓豆的應用領域，為蕓豆抗性淀粉在高脂血癥疾病方面的調節作用提供理論依據及數據支撐。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級雄性Wistar大鼠，體質量（200±20）g，生產許可證號：SCXK（遼）2015-0001，購自遼寧長生生物技術股份有限公司。

紫花蕓豆抗性淀粉由實驗室自制；高脂血癥飼料北京科澳協力飼料有限公司；TG測試盒、TC測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒南京建成生物工程研究所；天冬氨酸轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑片、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑片、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALKP）試劑片 北京安普生化科技有限公司；D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）測試盒 蘇州卡爾文生物技術有限公司；辛伐他汀片 山東鑫齊藥業有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Vet Test 8008全自動生化分析儀 北京安普生化科技有限公司；A360紫外分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；Multiskan Sky全波長酶標儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；SHP-250生化培養箱 上海森信實驗儀器公司；AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫花蕓豆抗性淀粉的制備

工藝流程：紫花蕓豆粉→堿法提取[12]→淀粉→調漿→預糊化→超聲-微波協同處理[13]→壓熱→普魯蘭酶酶解[14]→滅酶→老化→烘干→粉碎過篩→純化[15]→紫花蕓豆抗性淀粉

操作要點： 1 ） 堿法提取： 氫氧化鈉溶液（0.2 g/100 mL）浸提時間3 h，固液比1∶7；2）超聲-微波協同壓熱酶解法制備紫花蕓豆抗性淀粉：淀粉懸浮液質量分數20%，超聲-微波協同反應儀溫度40 ℃，微波功率300 W，超聲-微波協同處理20 min后于121 ℃壓熱30 min，冷卻后調節至pH 5，酶添加量（9 ASPU/g，以干基質量計），55 ℃恒溫酶解10 h，沸水浴滅酶。老化條件：4 ℃老化24 h。純化后抗性淀粉平均提取率為24.17%。

1.3.2 動物分組與造模

健康Wistar大鼠（雄性）48 只，飼養在動物實驗專用大鼠籠中。飼養條件：模擬循環光照12 h、室溫（24±2）℃、相對濕度（50±5）%。實驗大鼠適應性喂養1 周，稱量體質量并記錄。

根據大鼠體質量隨機分為6 組，即空白組、模型對照組、陽性藥物組、抗性淀粉處理組（高、中、低劑量組），每組8 只。所有大鼠每天自由飲水，空白組飼喂普通飼料，其余各組飼喂高脂血癥飼料，造模6 周。造模期間，每2 周剪尾取血一次，監測血清TG和TC含量（與空白組相比，其余各組大鼠血清TC、TG含量升高2～3 倍即表示模型成立）。造模成功后，空白組和模型組大鼠每日灌胃生理鹽水；抗性淀粉處理組每日灌胃不同劑量蕓豆抗性淀粉；陽性藥物組灌胃辛伐他汀，具體灌胃劑量見表1。實驗期間觀測大鼠日常精神、行為狀態，連續灌胃6 周后，最后一天禁食不禁水12 h，稱量大鼠體質量并記錄[16]。實驗鼠采取肌肉注射方式麻醉后，解剖，取肝臟、腹腔脂肪、小腸黏膜等組織分別稱質量并記錄。按下式計算肝臟指數。

表1 實驗動物灌胃藥劑設計Table 1 Grouping of experimental animals

1.3.3 血清指標測定

大鼠解剖后，立即腹主動脈取血，血液樣本室溫靜置30 min后4 ℃高速離心機離心，吸取上層血清分裝于滅菌EP管，于-80 ℃保存備用。利用全自動生化分析儀測定大鼠血液TC、TG濃度以及AST、ALT、ALKP活力，采用酶聯免疫吸附測定法檢測血液中抗氧化酶活力、DAO質量濃度及D-LA濃度。

1.3.4 肝臟、小腸病理組織切片檢測

取肝臟右小葉及小腸黏膜組織，生理鹽水沖洗后吸水紙吸拭表面，于10%中性甲醛溶液固定用以制作蘇木精-伊紅切片，光學顯微鏡下觀察病理組織并采集圖像[19]。

1.4 數據統計分析

運用SPSS 20軟件的方差分析法比較數據差異顯著性，P＜0.05及P＜0.01分別表示差異顯著和差異極顯著，用Origin軟件制作相關圖表。

2 結果與分析

2.1 蕓豆抗性淀粉對大鼠體質量、肝臟指數及腹腔脂肪質量的影響

圖1 各組大鼠體質量、肝臟指數及腹腔脂肪質量Fig. 1 Body mass, liver index and abdominal fat mass of rats in each group

由圖1A可知，各組大鼠體質量較空白組明顯升高，模型組與空白組體質量差異極顯著（P＜0.01），表明高脂血癥大鼠建模成功。經灌胃辛伐他汀及蕓豆抗性淀粉后，陽性對照組和抗性淀粉處理組大鼠體質量均明顯下降；與模型組相比，蕓豆抗性淀粉低劑量組大鼠體質量差異顯著（P＜0.05），其余各組大鼠體質量差異極顯著（P＜0.01）。由圖1B可知，模型組大鼠肝臟指數與空白組大鼠相比存在極顯著差異（P＜0.01）；灌胃后，與模型組大鼠相比，除低劑量組，其他各灌胃組大鼠肝臟指數較模型組不同程度升高，差異顯著（P＜0.05）。由圖1C可知，模型組大鼠腹腔脂肪質量較空白組大鼠存在極顯著差異（P＜0.01）。經灌胃處理后，除低劑量組外，抗性淀粉中、高劑量組和陽性對照組大鼠腹腔脂肪質量較模型組相比存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 蕓豆抗性淀粉對大鼠血脂和肝功能相關指標的影響

圖2 蕓豆抗性淀粉對各組大鼠血清TC、TG濃度及ALKP、AST、ALT活力的影響Fig. 2 Effect of resistant starch from purple speckled kidney beans on serum total cholesterol and triglyceride concentrations and alkaline phosphatase, aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase activity in each group

如圖2所示，飼喂高脂飼料的模型組大鼠與空白組大鼠之間血清TC、TG濃度存在極顯著差異（P＜0.01），且模型組大鼠血清ALKP、AST、ALT活力顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，陽性對照組大鼠血清TC、TG濃度降低，其中TG濃度差異極顯著（P＜0.01），ALKP、AST、ALT活力極顯著降低（P＜0.01）。抗性淀粉灌胃干預后，與模型組相比，中、高劑量組大鼠TC、TG濃度及ALKP、AST活力差異極顯著（P＜0.01），ALT活力差異顯著（P＜0.05）；低劑量組大鼠血清ALKP、ALT活力雖有一定程度下降，但不存在顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 蕓豆抗性淀粉對高脂血癥大鼠氧化應激的影響

如圖3所示，高脂血癥模型組大鼠血清SOD、GSH-Px活力相比于空白組大鼠極顯著降低（P＜0.01），MDA濃度極顯著升高（P＜0.01）。灌胃給藥后，與模型組大鼠相比，各灌胃組大鼠血清SOD和GSH-Px活力顯著回升（P＜0.05，P＜0.01），MDA濃度不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），但低劑量組MDA濃度差異不顯著。

圖3 蕓豆抗性淀粉對各組大鼠血清SOD、GSH-Px活力和MDA濃度的影響Fig. 3 Effect of resistant starch from purple speckled kidney beans on serum SOD, GSH-Px activity and MDA concentration in each group

2.4 蕓豆抗性淀粉對高脂血癥大鼠腸屏障損傷的影響

由圖4可知，模型組大鼠血清DAO及D-LA水平較空白組大鼠極顯著升高（P＜0.01），灌胃后，各組大鼠血清DAO及D-LA水平較模型組呈不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），說明蕓豆抗性淀粉能在一定劑量下抑制DAO及D-LA的釋放。

圖4 蕓豆抗性淀粉對各組大鼠血清DAO、D-LA水平的影響Fig. 4 Effect of resistant starch from purple speckled kidney beans on serum DAO and D-LA levels in rats

2.5 大鼠肝臟及小腸病理組織切片觀察結果

圖5 大鼠肝臟病理組織蘇木精-伊紅染色觀察結果（×100）Fig. 5 HE staining of liver tissues of rats (× 100)

由圖5可知，空白組大鼠肝臟小葉組織細胞整體形態結構完整，胞核清晰可見，肝細胞圍繞中央靜脈以散射狀規整排列形成細胞索胞間，無明顯邊界分隔。而模型組大鼠肝臟組織腫大變性，損傷嚴重。肝細胞膨大腫脹，細胞核清晰可見但分布偏離，細胞漿質間充盈著大量形狀大小各異的脂肪滴空泡，可觀察到大量炎性細胞浸潤和脂肪性病變。灌胃處理后，辛伐他汀組大鼠肝細胞結構相對清晰完整，肝細胞索排列整齊，僅存在極少量脂滴空泡，接近空白組大鼠肝臟切片結果。與模型組相比，蕓豆抗性淀粉各劑量組大鼠肝臟損傷程度顯著減輕，中、高劑量組大鼠肝細胞腫脹程度改善明顯，未出現明顯細胞變性壞死現象，雖偶見脂肪空泡，但肝細胞索排列清晰，而低劑量組大鼠可見清晰肝細胞索但排列紊亂，空泡數量減少，但仍存在較大脂滴空泡，表明不同劑量蕓豆抗性淀粉對大鼠肝臟損傷的修復程度不同。

圖6 各組大鼠小腸組織蘇木精-伊紅染色觀察結果（×100）Fig. 6 HE staining of small intestine tissues of rats in each group (× 100)

由圖6可知，模型組大鼠小腸組織形態受損，腸絨毛倒伏、脫落缺失，絨毛高度降低且參差不齊；腸黏膜肌層厚度降低，間隙寬大，隱窩深度增加。灌胃給藥后，各組大鼠小腸組織形態較為完整，層次分明，與模型組大鼠相比，各灌胃組大鼠小腸絨毛高度顯著增加，腸黏膜間連接緊密，肌層厚度增加，隱窩深度降低，表明蕓豆抗性淀粉能在一定程度減緩高脂血癥對大鼠小腸黏膜機械屏障損傷。

3 討 論

長期高脂飲食會影響肝臟代謝，打破能量平衡，破壞脂質穩態。Stancu等[20]研究發現，飲食中的飽和脂肪和過量膽固醇可能會激活小腸和肝臟的內質網應激和氧化應激，引發肝臟及腸道功能損傷。抗性淀粉被認為是功能性膳食纖維的一種，可抵抗人體小腸消化，被結腸菌群利用發酵對機體產生積極作用[21]。研究表明，多食用富含抗性淀粉等膳食纖維類食物能降低高脂血癥的發病風險[22]。

臨床研究發現，高脂血癥與血清中TC和TG水平密切相關[23]。當血液TC、TG水平高于正常水平時，血液內附著物增多，黏稠度升高，堵塞血管造成組織缺血性壞死，誘發大鼠肥胖致使腹腔脂肪堆積。本實驗測定大鼠基本狀況指標及血脂水平，結果表明灌胃蕓豆抗性淀粉后，中、高劑量組大鼠體質量、肝臟指數、腹腔脂肪質量顯著降低。這與Lockyer等[24]的研究結果相似，該研究發現抗性淀粉能量值為一般碳水化合物熱量的10%，約為8.37 kJ/g，其可作為低能量物質減少機體能量攝入。相關研究發現，抗性淀粉是3 個或3 個以上單體單元的碳水化合物聚合物，由大量的直鏈淀粉分子經歷老化重結晶過程形成穩定的雙螺旋結構，難以在體內被酶解消化，說明抗性淀粉的攝入可延緩胃排空率、縮短其在腸道運轉時間、控制體內葡萄糖轉化，在結腸內發酵產生短鏈脂肪酸，刺激膽汁酸分泌增加，干預TG和膽固醇的合成，從而降低血清TG和TC的濃度，與本實驗中灌胃組大鼠血脂濃度降低結果一致，證實紫花蕓豆抗性淀粉能在一定劑量下控制體質量，減輕腹腔脂肪質量，改善血脂水平。

高脂血癥病發時體內產生過量脂類物質進入肝臟，肝臟超負荷運轉使脂肪堆積，造成肝臟脂肪性病變，引發肝功能異常。ALKP和ALT主要分布在肝細胞中，AST分布在線粒體中，三者作為肝臟內關鍵的功能性酶，可從受損的肝細胞質分泌進入血液[25]，因此血液中ALKP、AST、ALT活力可衡量肝臟損傷程度。實驗結果顯示，與模型組大鼠相比，不同劑量組大鼠血清中ALKP、AST、ALT活力均呈不同程度下降。結合肝臟病理切片結果可知，各灌胃劑量組大鼠肝臟組織損傷程度較模型組大鼠顯著減輕，說明蕓豆抗性淀粉對高脂血癥大鼠肝功能損傷具有一定的修復作用，可減少炎性細胞浸潤，提升細胞活力。

高脂血癥會引發機體游離脂肪酸和自由基增多，破壞體內抗氧化酶系統[26]，加劇肝臟氧化應激反應和脂肪酸過氧化，造成肝臟損傷。而肝臟是第一個通過門靜脈獲得內源性代謝產物和外源性代謝產物的器官，也是血脂與脂蛋白結合和代謝關鍵場所[27]，其借助肝門靜脈與腸道互聯，兩者通過血液回流和肝腸循環的方式相互調節，使得肝臟疾病與腸屏障功能密切相關。當腸道功能受損時，腸黏膜上皮細胞緊密連接被破壞，導致機械屏障通透性增加，D-LA和DAO分別作為腸內微生物發酵產物及細胞漿中高活性酶被分泌到血液中。實驗通過測定機體氧化酶活性及血清D-LA和DAO判斷機體氧化應激及腸屏障損傷程度，結果表明SOD和GSH-Px活力升高，MDA水平、DAO及D-LA活力降低。分析可能是機體攝入抗性淀粉時，抗性淀粉進入結腸，產生的短鏈脂肪酸被機體吸收進而影響腸道激素合成。此時外源性代謝產物從腸道通過門靜脈循環進入肝臟潛在地調節肝臟代謝[28]，抑制了膽固醇合成并刺激脂肪酸分解代謝，通過減少脂質過氧化物的形成，緩解機體氧化應激反應，減輕對腸道內質網應激影響，提高腸道上皮細胞活性[29]。結合小腸黏膜切片可知，蕓豆抗性淀粉組大鼠小腸黏膜組織完整，絨毛高度增加，隱窩深度降低，說明一定劑量的蕓豆抗性淀粉可通過清除機體自由基起到抗氧化應激作用，從而減緩高脂血癥造成的肝臟損傷，近一步修復肝臟代謝障礙所致的腸屏障損傷。

綜上所述，蕓豆抗性淀粉具有良好的控制大鼠體質量，降低血脂，修復高脂血癥大鼠肝臟及腸道屏障損傷作用，且中、高劑量組較低劑量組效果更顯著。本研究可為雜糧豆類抗性淀粉在高脂血癥造成的肝損傷及腸屏障修復方面的應用提供一定的理論依據及數據支持。