冷藏過程中蝦夷扇貝橫紋肌微觀結構變化與肌原纖維蛋白穩定性

姜明慧，田元勇,2,*，閆麗新，王選飛，袁春紅，劉俊榮,2

（1.大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023；2.遼寧省水產品加工及綜合利用重點開放實驗室，遼寧 大連 116023；3.日本巖手大學農學部食料生產環境學科，日本 盛岡 0208550）

蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）是我國重要的水產養殖貝類之一。我國蝦夷扇貝年產量高達30萬 t，零售價40～50 元/kg，產值達數百億元[1]，但活貝流通過程中運輸成本高、風味下降嚴重等問題嚴重制約行業的發展[2]。我國雖然貝類產量居世界首位，但高端刺身級產品卻鮮有銷售，這除了與消費習慣有關之外，與基礎理論研究存在局限也有很大關聯。在盛行食用刺身的日本，扇貝以閉殼肌生鮮品銷售方式占主要地位，研究人員圍繞著貯藏溫度[3]、氧氣濃度[4]、清洗方法[5]以及季節[6]等因素對閉殼肌品質的影響進行了大量研究。蝦夷扇貝閉殼肌包括橫紋肌和平滑肌兩部分，其中橫紋肌所占比重大，其冰藏過程中的突出問題是由于肌肉收縮引起的質地變硬、汁液流失、口感變差。橫紋肌的收縮舒張是以ATP為能量物質，在Ca2+及Mg2+參與下肌絲滑動的橫橋循環過程[7]。貯藏過程中由于ATP合成終止導致橫橋循環中斷，進而引發了肌肉僵直。Ca2+在橫紋肌的收縮過程中起到關鍵調節作用，貯藏過程中由于肌質網對Ca2+調節能力降低也加速了ATP的降解[8]。平滑肌雖然占比較小，但對活貝長時間維持夾持狀態發揮著重要的作用，其收縮機制[9]、鹽溶解性等[10]與橫紋肌存在較大差異。此外，扇貝粗絲由副肌球蛋白和肌球蛋白共同構成，可結合7分子肌球蛋白，與可結合3分子肌球蛋白的脊椎魚類以及可結合4分子肌球蛋白的甲殼類蟹存在顯著差異[11]。這種蛋白結構的差異可能對不同水產品的貯藏特性產生影響。目前，扇貝橫紋肌收縮機制的相關研究較多，但是關于肌肉收縮引發的肌肉微觀結構和蛋白理化性質的變化缺少深入研究。本研究為解決蝦夷扇貝橫紋肌貯藏過程中由于肌肉收縮引發的“硬化”問題，將蝦夷扇貝橫紋肌進行冷藏，對僵直前、中、后不同階段的品質變化進行了分析。通過透射電子顯微鏡觀察橫紋肌的組織結構變化，測定ATP含量、肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase及Mg2+-ATPase活力，分析蛋白鹽溶解性的變化規律，并針對ATP含量對蛋白鹽溶解性的影響進行了深入探討。通過以上研究以期明確橫紋肌冷藏過程中肌原纖維蛋白理化性質的變化規律，為最終解決貯藏過程中的“硬化”問題提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）由大連獐子島股份有限公司提供，質量（143.41±16.58）g、殼長度（11.17±0.27）cm。

乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA）、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid，EGTA）、乙酸、氯化鈉、氫氧化鉀 天津市科密歐化學試劑有限公司；腺嘌呤核苷三磷酸、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑、β-巰基乙醇、無水甲醇 美國Sigma公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鹽酸、硫酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、高氯酸 國藥集團化學試劑有限公司；碘化鉀 上海麥克林生化科技有限公司；馬來酸、標準牛血清白蛋白、考馬斯亮藍R-250 北京索萊寶科技有限公司；鉬酸銨、米吐爾 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。氫氧化鉀、無水甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀均為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；AE-6500垂直電泳槽 日本ATTO公司；OS-I型回旋脫色搖床 大連競邁公司；JEM-1200EX透射電子顯微鏡 日本電子公司；UV-1800PC紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；Synergy H1酶標儀 美國柏騰公司；HG-200高速分散均質機 日本HSIANGTAI；GL-21M高速冷凍離心機 德國HERMLE Labortechnik GmbH公司；BS224S型精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；PB-10 pH計 德國Sartorius公司；Milli-Q超純水凈化儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

活品底播蝦夷扇貝送達至實驗室后，立即放入充氧循環海水中緩沖處理12 h，待其生理狀態穩定后快速開殼取橫紋肌。置于預冷的塑料盒內，覆保鮮膜密封后4 ℃低溫貯藏，分別于第0、5天觀察外觀和微觀形態，在第0、2、5天時取樣進行指標測定。

1.3.2 橫紋肌的微觀結構觀察

取扇貝橫紋肌，從中心位置切取1 mm×1 mm×3 mm的長方體，放入預冷的體積分數2.5%戊二醛溶液中固定2 h后，用4 ℃ 0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗3 次，每次10～15 min。再用0.1 g/L四氧化鋨室溫下固定1～2 h，用0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗3 次。之后分別用體積分數50%、70%、80%、90%乙醇溶液逐級脫水，再用無水乙醇脫水1 次，環氧丙烷置換2 次，每次10 min。脫水后用溶劑I（V（環氧丙烷）∶V（包埋劑）＝1∶1）滲透1～2 h，再用溶劑II（V（環氧丙烷）∶V（包埋劑）＝1∶2）滲透過夜，最后用純包埋劑滲透4～5 h。將處理好的組織塊包埋在包埋模板中用烤箱烘干，分別于37、45、60 ℃下烘烤12、12、24 h，聚合硬化后形成包埋塊。用玻璃刀將包埋塊切成薄片后，用0.2 g/L醋酸雙氧鈾避光染色30 min，再用檸檬酸鉛染色10～20 min。超薄切片制作完成后利用JEM-1200EX透射電子顯微鏡對肌肉組織微觀結構進行觀察。

1.3.3 SDS-PAGE分析

將蝦夷扇貝橫紋肌肌肉切碎，加入10 倍體積緩沖液（含0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）攪勻，10 000 r/min、30 s均質3 次，即得到橫紋肌全蛋白勻漿液。使用電泳上樣液（含0.14 mol/L SDS、2 mol/L尿素、0.43 mol/Lβ-巰基乙醇、0.1 g/L溴酚藍、50 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8）將蛋白質量濃度稀釋至1～2 mg/mL，混勻后100 ℃條件下加熱5 min，即得到電泳樣品，進樣量為15 μL。采用垂直板進行PAGE，以質量分數5%濃縮膠和7.5%分離膠配制膠板。采用考馬斯亮藍R-250染色、脫色液（V（甲醇）∶V（乙酸）∶V（去離子水）＝3∶1∶6）進行脫色，掃描膠片后得到電泳圖譜。

1.3.4 橫紋肌ATP及其關聯物含量測定

ATP及其關聯物（ADP、AMP、IMP、HxR、Hx）提取方法參照Hu Yaqin等[12]的方法并稍作修改。準確稱取1.0 g橫紋肌，加入10 mL預冷的0.8 mol/L高氯酸，冰浴下搗碎10 min，用2.0 mol/L KOH溶液調節pH值至2.0～3.5后用超純水定容至20 mL。5 000×g條件下離心5 min，取4.0 mL上清液過膜后加入1.0 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），搖勻，采用反向高效液相色譜測定ATP及其關聯化合物含量。高效液相色譜分析條件：SinoChrom ODS-BP色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；二極管陣列檢測器；流動相：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5），固定相：甲醇；檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.7 mL/min；進樣量：0.02 mL；分流比：8∶2。利用K值表征水產品的新鮮程度，按式（1）計算。

式中：ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx分別表示該物質的含量/（μmol/g）。

1.3.5 橫紋肌肌原纖維蛋白提取及Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活力測定

肌原纖維蛋白提取參照吳忠等[13]的方法并稍作修改。將蝦夷扇貝橫紋肌切碎，加入10 倍體積pH 7.5的緩沖液（含0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，下同）攪勻，5 000×g離心5 min去上清液，重復漂洗3 次。加入10 倍體積緩沖液，10 000 r/min、30 s均質3 次，5 000×g離心5 min去上清液，重復漂洗3 次。加入適量緩沖液懸濁，過雙層紗布即得到肌原纖維蛋白，全程操作均在4 ℃下進行。利用雙縮脲法[14]測蛋白質量濃度，然后用緩沖溶液將蛋白質量濃度調至1.0 mg/mL用于酶活力測定。

Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活力測定參考Ojima等[15]的方法并稍作修改，在玻璃管中加入9.0 mL反應液（Ca2+-ATPase：2 mmol/L ATP、5 mmol/L CaCl2、25 mmol/L pH 7.0 Tris-馬來酸、0.5 mol/L KCl；Mg2+-ATPase：2 mmol/L ATP、5 mmol/L MgCl2、25 mmol/L pH 7.0 Tris-馬來酸、0.1 mol/L KCl），置于20 ℃水浴鍋內，5 min后加入1 mL 1 mg/mL的肌原纖維蛋白懸濁液開始反應。分別于0、2、5、10、15、20、25、30 min時取出1.0 mL混合液，加入0.5 mL 2.6 mol/L高氯酸以終止反應。靜置沉淀后取0.5 mL上清液加入1.75 mL硫酸鉬酸銨和0.25 mL米吐爾，混勻后25 ℃水浴發色45 min，640 nm波長處測定吸光度。Ca2+-ATPase及Mg2+-ATPase活力以每毫克蛋白每分鐘分解ATP產生無機磷的物質的量表示，具體計算見公式（2）。

式中：ρ為反應體系中蛋白質量濃度/（mg/mL）；t為反應時間/min。

1.3.6 橫紋肌蛋白鹽溶解度測定

將蝦夷扇貝橫紋肌切碎，加入10 倍體積緩沖液（含0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），10 000 r/min、30 s均質3 次，得到全蛋白勻漿液。將蛋白質量濃度調至10 mg/mL，通過添加NaCl和去離子水，將體系中NaCl終濃度分別調至0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mol/L，蛋白終質量濃度調整至5 mg/mL。混勻后靜置20 min，10 000×g條件下離心10 min，通過上清液蛋白質量濃度和體積計算溶解度。蛋白鹽溶解度的計算見公式（3）。

式中：ρ1為全蛋白勻漿液中蛋白質量濃度/（mg/mL）；V1為全蛋白勻漿液體積/mL；ρ2為離心后上清液中蛋白質量濃度/（mg/mL）；V2為離心后上清液體積/mL。

1.3.7 橫紋肌蛋白鹽溶解度的測定及蛋白組分分析

在1.3.6節中得到的橫紋肌全蛋白勻漿液中添加外源ATP，并通過添加去離子水和NaCl將體系中ATP終濃度分別調至0、1、2、5、10、20 mmol/L，NaCl終濃度為0.5 mol/L，蛋白終質量濃度為5 mg/mL，混勻后靜置20 min，10 000×g條件下離心10 min，測定上清液體積和蛋白質量濃度后，按公式（3）計算蛋白鹽溶解度。

將新鮮的扇貝橫紋肌切碎后分為3 組，分別加入10 倍體積的緩沖液A（含5 mmol/L EDTA、0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）、緩沖液B（含5 mmol/L EGTA、0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）和緩沖液C（含0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），10 000 r/min、30 s均質3 次后，分別作為EDTA組、EGTA組及對照組，對均質后3 組中ATP、ADP、AMP含量和鹽溶解度、上清液蛋白組成進行比較。

1.4 數據處理與分析

實驗數據均采用平均值±標準差的形式表示，用Excel 2003軟件進行方差統計分析及圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 蝦夷扇貝冷藏期間橫紋肌組織結構的變化

2.1.1 蝦夷扇貝外觀形態變化

圖1 蝦夷扇貝橫紋肌冷藏期間的形態變化Fig. 1 Shrinkage of scallop striated adductor muscle during chilling storage

如圖1所示，橫紋肌在貯藏過程中僵直明顯，質地變硬，光澤度及飽滿度變差，體積明顯縮小。貯藏5 d后其厚度減少了20%。通常魚類死后，貯藏過程中魚體在肌肉收縮力和骨骼支撐力的作用下，呈現“僵直-解僵”過程并出現裂縫。而扇貝橫紋肌離體后無骨骼支撐，貯藏過程中肌肉收縮導致宏觀呈現出逐漸“硬化”的狀態，未觀察到“解僵”過程和裂縫現象。這種宏觀變化對肌肉的微觀結構和功能性也產生了較大影響，如攀鱸魚在貯藏過程中持水能力會逐漸下降[16]。同時，肌肉中水分含量的降低也會對其微觀結構產生影響[17]。

2.1.2 蝦夷扇貝微觀結構變化

在貯藏開始時，蝦夷扇貝橫紋肌肌纖維的結構完整，Z線清晰，肌節平均長度為0.75 μm（圖2A1）；貯藏5 d后肌纖維結構仍相對完整，但Z線變得模糊，肌束間隙增大，肌節平均長度為0.62 μm，比0 d時明顯縮短約17.33%，此外，肌原纖維之間可觀察到大量空泡（圖2A2）。0 d 時橫紋肌中線粒體結構完整、數量多、體積大（圖2B1）；5 d時線粒體出現明顯空泡樣變，嵴斷裂嚴重，但雙層膜結構仍完整（圖2B2）。Ayala等[18-19]對鯛魚肌肉微觀結構進行觀察也發現，在4 ℃冷藏5 d后，Z線出現輕微的斷裂，線粒體腫脹且內部渾濁。以上結果說明冷藏期間橫紋肌的微觀結構仍比較完整，肌纖維結構比較清晰；但肌纖維連接處出現大量空泡、Z線模糊。因此需進一步探討蝦夷扇貝冷藏過程中是否發生了蛋白質的降解。

圖2 橫紋肌冷藏期間微觀結構變化Fig. 2 Changes in microstructure of striated adductor muscle during chilling storage

2.1.3 蝦夷扇貝橫紋肌蛋白組成的變化

圖3 蝦夷扇貝橫紋肌冷藏期間蛋白組成的變化Fig. 3 Changes in protein components in scallop striated adductor muscle during chilling storage

利用SDS-PAGE對貯藏0、2、5 d的扇貝橫紋肌進行全蛋白組分分析，結果如圖3所示，貯藏期間肌球蛋白、副肌球蛋白、肌動蛋白等各組分的蛋白含量均未出現明顯變化，未觀察到新條帶的產生。蝦夷扇貝橫紋肌在冰藏條件下，水溶性蛋白的含量在5 d內也無顯著變化[20]。相比之下，鱔魚肌肉在冷藏5 d內，肌球蛋白和肌動蛋白均出現了明顯的降解[21]。可能是與魚類肌肉相比，一方面扇貝橫紋肌的蛋白性質比較穩定；另一方面，本研究在前處理過程中除去了消化腺，減少了冷藏期間蛋白酶對蛋白質的降解。因此蝦夷扇貝生鮮閉殼肌產品的貯藏優勢較大。

2.2 蝦夷扇貝冷藏期間橫紋肌品質變化

2.2.1 ATP及其關聯物含量變化

圖4 蝦夷扇貝橫紋肌冷藏期間ATP及其關聯物含量變化Fig. 4 Changes in contents of ATP and related compounds in scallop striated adductor muscle during chilling storage

蝦夷扇貝橫紋肌冷藏期間ATP及其關聯物含量變化如圖4所示，0 d時的ATP含量為4.39 μmol/g。2 d時中ATP含量為1.98 μmol/g，未檢測到HxR和Hx，K值為0。K值是評價水產品鮮度的常用指標，一般認為水產品K值小于20%時為非常新鮮。貯藏5 d時仍檢測到ATP含量為1.07 μmol/g，雖然檢測到了HxR及Hx，但K值僅為11.6%。相比之下，活品扇貝在離水干露3 d時出現死亡，ATP耗盡[22]；大菱鲆和帶魚在冷藏5 d時K值升高至40%左右，處于輕微腐敗初期[23-24]。表明扇貝橫紋肌在冷藏期間新鮮度較好、品質下降慢。

2.2.2 肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase及Mg2+-ATPase活力變化

圖5 蝦夷扇貝橫紋肌冷藏期間肌原纖維蛋白的Ca2＋-ATPase及Mg2＋-ATPase活力變化Fig. 5 Changes in Ca2+-ATPase and Mg2+-ATPase activity in scallop striated adductor muscle during chilling storage

肌肉蛋白的功能特性及質地特性與肌原纖維蛋白的性質密切相關[25-26]，通過測定肌原纖維蛋白中肌球蛋白的Ca2+-ATPase活力可較好地反映肌肉品質。0 d時蝦夷扇貝橫紋肌中提取的肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活力為0.41 μmol/（mg·min），冷藏5 d后其活力為0.50 μmol/（mg·min），Ca2+-ATPase活力取決于肌原纖維蛋白中的肌球蛋白，而不受肌動蛋白的影響[26-27]，因此推測冷藏過程中肌球蛋白并未發生變性。此外，肌球蛋白的Mg2+-ATPase活力能夠被肌動蛋白激活，常用來反映肌球蛋白和肌動蛋白的相互作用[28]，并且Mg2+-ATPase具有更高的敏感性，在肌原纖維蛋白經過長時間冷藏[29]或低離子緩沖溶液反復漂洗后[30]，該活力會出現異常升高。然而在本研究中，Ca2+-ATPase活力在冷藏期間也出現了反常的升高現象，推測是蝦夷扇貝橫紋肌冷藏過程中的肌肉收縮使得肌動蛋白和肌球蛋白的結合更加緊密，肌球蛋白與肌動蛋白的結合作用以及提取的肌原纖維蛋白中殘留的Mg2+，共同激活了Mg2+-ATPase的活性，導致實際檢測到的Ca2+-ATPase活力中包含了Mg2+-ATPase的部分，使得Ca2+-ATPase活力最終呈現出升高的現象。因此，進一步討論肌動蛋白和肌球蛋白的結合作用是否也對肌肉蛋白溶解性產生了影響。

2.2.3 橫紋肌冷藏期間蛋白鹽溶解度變化

圖6 蝦夷扇貝橫紋肌冷藏期間蛋白溶解性變化Fig. 6 Changes in salt solubility of protein in scallop striated adductor muscle during chilling storage

蛋白的溶解度與肌球蛋白桿部的性質密切相關，如肌球蛋白桿部的降解、聚合會導致蛋白的鹽溶解度下降[31-32]。由圖6A可知，貯藏相同的時間，蝦夷扇貝橫紋肌的蛋白溶解度隨著NaCl濃度的增加均呈線性上升趨勢，貯藏時間對蛋白的鹽溶解度影響不大。通常，隨NaCl濃度的增加，魚類肌肉蛋白溶解度呈S型上升，在NaCl濃度為0.3 mol/L左右時其蛋白的溶解度迅速升高，在0.5 mol/L附近幾乎全部溶出，溶解度可達到80%左右[33]，且肌肉鮮度越高溶解度越高。吳忠[34]研究發現，蝦夷扇貝橫紋肌的水溶性蛋白質量分數約為39%，鹽溶性蛋白質量分數為34%。但在本研究中，扇貝在鮮度很高的0 d時，橫紋肌肌肉蛋白鹽溶解度依然很低，在1.0 mol/L NaCl溶液中的溶解度僅約為60%，并且上文中Ca2+-ATPase活力實驗證明了肌球蛋白并未發生變性，推測可能由于ATP的降解促使肌球與肌動蛋白緊密結合形成了肌動球蛋白，出現了超沉淀現象，對肌肉蛋白的鹽溶解性產生了影響。為驗證該推測，在含0.5 mol/L NaCl的扇貝肌肉勻漿液中添加外源ATP，再次評價了肌肉蛋白鹽溶解度的變化，結果如圖6B所示。貯藏不同時間的橫紋肌的肌肉蛋白在添加超過1.0 mmol/L的ATP后，蛋白溶解度均達到了80%以上。表明蝦夷扇貝橫紋肌由于肌動蛋白和肌球蛋白的結合作用導致了鹽溶解性降低。并且在冷藏5 d內，肌球蛋白與肌動蛋白在結合狀態下通過添加ATP可重新解離，表明其并未喪失活性。

2.2.4 ATP對橫紋肌蛋白鹽溶解度的影響

圖7 ATP對蝦夷扇貝肌肉蛋白鹽溶解性的影響Fig. 7 Effect of ATP on salt solubility of scallop striated adductor muscle proteins

貯藏0 d的扇貝橫紋肌并未出現肌肉收縮現象致使肌球和肌動蛋白結合，但蛋白溶出效果仍然很差。推測可能是在均質過程中細胞破碎導致Ca2+流出，激活了Ca2+-ATPase活性，而較高的Ca2+-ATPase活性會導致ATP迅速分解，進而引起肌動蛋白和肌球蛋白的結合，導致蛋白溶解度較差；因此，通過添加EDTA和EGTA螯合肌肉中的Mg2+、Ca2+等金屬離子來控制其ATPase活性，進一步探究均質過程導致的ATP含量變化對肌肉蛋白鹽溶解性的影響。如圖7所示，對照組的均質過程導致肌肉中ATP完全被消耗，而EDTA處理組和EGTA處理組中仍能檢測到少量的ATP，分別為1.17 μmol/g和0.34 μmol/g。同時，EGTA添加組中，由于肌肉中依然有ATP和Mg2+殘余，促進了肌球和肌動蛋白解離，因此，在0.4 mol/L NaCl濃度下，溶解度由對照組的25%上升到了70%（圖7B），并且和對照組相比在上清液中可檢測到大量的肌球蛋白（圖7C、D）。Niki等[35]的研究也證明，在肌原纖維蛋白中同時添加Mg2+、EGTA和ATP能有效促進肌球與肌動蛋白的解離。

3 結 論

蝦夷扇貝橫紋肌在冷藏5 d后處于完全“硬化”的狀態。此時，肌肉中線粒體出現空泡樣變，嵴斷裂嚴重，但肌纖維的微觀結構仍比較完整、肌肉中仍有ATP殘留、K值在5 d 時僅為11.6%，鮮度較高。“硬化”狀態下，ATP的降解促使肌動蛋白和肌球蛋白緊密結合，激活了肌球蛋白的Mg2+-ATPase，并形成了肌動球蛋白超沉淀，導致肌肉蛋白鹽溶解性降低，但是通過外源添加ATP后蛋白溶解度明顯升高，表明這種結合作用是可逆的，橫紋肌肌肉蛋白仍具有較好的功能性。探討控制蝦夷扇貝橫紋肌“硬化”的方法，對于提高產品的品質和延長貨架期非常重要，有必要繼續深入研究。