腺相關病毒載體在基因治療領域中的應用和挑戰

譚靚，李泰明

腺相關病毒載體在基因治療領域中的應用和挑戰

譚靚，李泰明

（中國藥科大學 生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009）

腺相關病毒載體是基因治療領域中最有前景的基因遞送平臺之一，它具有免疫原性較低、安全性高、制備簡單、可大規模生產等優勢，尤其在安全性方面遠超其他病毒載體。近幾年，在難治性疾病的臨床治療中，腺相關病毒基因載體發揮著越來越重要的作用，但由于仍存在一些待解決的問題，尚未在臨床中大規模應用。綜述了目前腺相關病毒基因載體在基因治療領域中的應用趨勢和所面對的挑戰，并進行了展望。

基因治療；腺相關病毒載體；基因遞送；表達效率

1 前言

腺相關病毒（Adeno-associated viruse，AAV）載體是以AAV基因組為骨架改造而來的基因遞送工具。腺相關病毒屬于細小病毒科的低致病性病毒，它的基因組為線性單鏈DNA，大小約4.7 kB，在基因組兩端分別有一條反向末端重復序列（Inverted terminal repeat，ITR），其中的D序列與病毒基因組高效釋放、選擇性復制和包裝密切相關，基因組編碼區有2個開放閱讀框，分別編碼4種Rep蛋白和3種Cap蛋白，它們分別在基因組復制、病毒裝配以及包裝中發揮著作用[1]。在設計AAV載體基因組時，需要將編碼區基因序列替換為目的基因和相關功能片段，僅保留兩端反向末端重復序列。在其生產時采用三質粒共轉染法，即將帶有AAV載體基因組的質粒、腺病毒輔助基因質粒、表達cap和rep蛋白的質粒共轉染細胞。

AAV按血清試驗結果可以分為不同種，目前已有13種AAV血清型（AAV1～AAV13），分別靶向不同的受體和組織。在制備腺相關病毒載體時，通常根據疾病部位和靶向組織的不同，選擇不同的血清型。具體受體及靶向目標如表1所示[2]。

與慢病毒載體、腺病毒載體、逆轉錄病毒載體等其他常用病毒載體相比，AAV載體在沒有輔助病毒的情況下并不發生產毒性感染，具有高安全性、低免疫原性、宿主細胞范圍廣（感染分裂和非分裂細胞）、易生產、高穿透性、長時表達、定點整合等優點，在基因治療領域具有極大的應用前景[3]。

2 腺相關病毒基因載體在基因治療中的應用

2.1 使用腺相關病毒基因載體介導基因置換

基因置換指通過使用特定方法，將治療性基因遞送入指定細胞，利用染色體同源重組原理置換掉功能失常的基因。此技術適用于治療隱性單基因遺傳病，并在臨床上取得了最大的成功，例如Luxturna，它是以AAV2為載體的基因治療藥物，通過眼部注射，遞送RPE65基因表達框治療由雙等位基因突變引起的視網膜營養不良[4]。在2000年早期，從靈長類動物中發現的一個新的AAV血清型及突變體，使AAV載體藥物在血管注射后的轉基因傳遞更為廣泛[5]。并且，一些AAV基因置換臨床試驗通過替換此衣殼取得了較好的治療效果，例如治療A/B型血友病、治療杜氏肌營養不良癥等。

表1 不同血清型AAV的受體及靶向目標

AAV靶向受體靶向目標 AAV1唾液酸肌肉、腦、眼、胰腺 AAV2硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，層黏連蛋白受體腎 AAV3硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，層黏連蛋白受體肝腫瘤 AAV4唾液酸肺、腎、腦、眼 AAV5唾液酸肺、腦、眼 AAV6唾液酸硫酸，乙酰肝素蛋白聚糖心臟、肌肉、肺 AAV7未知肌肉、眼 AAV8層黏連蛋白受體肌肉、腦、眼、胰腺、肝 AAV9半乳糖，層黏連蛋白受體肌肉、腦、眼、胰腺、腎、心臟、肺 AAV10未知腦、新生組織、小腸、結腸 AAV11未知未知 AAV12未知鼻腔 AAV13硫酸乙酰肝素蛋白聚糖未知

2.2 使用腺相關病毒基因載體介導基因編輯

利用基因編輯技術可以直接修復人體內潛在的疾病基因，它通常包括兩個步驟：引起基因組靶向DNA斷裂；進行DNA修復實現基因組改變。CRISPR-Cas9是十分重要的基因編輯技術，能夠通過向導RNA的設計，實現靶向基因組DNA位點的精確定位，并且設計簡單，易操作，成為目前科學研究和臨床應用的熱點。與腺病毒、慢病毒等相比，AAV作為一種免疫原性較低的病毒載體，十分適用于CRISPR-Cas9系統的遞送，并且由于其宿主基因組整合率較低，不會引起CRISPR-Cas9在體內的長期表達，降低了基因編輯脫靶突變概率和致癌風險。除此之外，AAV載體也可以參與DNA修復過程，遞送具有靶序列同源重組臂和治療基因序列的基因組[6]，最終通過與Cas9蛋白編碼基因同時遞送，實現基因治療。

2.3 使用腺相關病毒基因載體介導基因沉默

基因沉默技術主要用于治療由獲得毒性突變引起的單基因疾病。其中，由AAV載體介導的CRISPR-Cas9基因編輯技術單獨使用也可以從mRNA水平實現高特異性的基因沉默[7]。然而，RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術目前占據了rAAV基因沉默平臺的主導地位，它是mRNA水平調控的重要機制。shRNA在用基因沉默技術時，存在基因沉默脫靶的可能。使用Pol III啟動時，高表達的shRNA可能會影響內源性miRNA的生成途徑，引起細胞毒性[8]。并且，AAV載體在遞送編碼shRNA的基因DNA序列時，載體基因組可能會因為DNA序列的短發卡結構而被截斷，使基因組的同源性受影響[9]。然而，使用AAV載體遞送編碼siRNA的工程化pre-miR-33可以解決上述問題，基因沉默脫靶概率和細胞毒性被降低，并且基因沉默效率與shRNA不相上下[10]。

3 腺相關病毒基因載體在基因治療中的挑戰

3.1 待優化的病毒包裝系統

AAV病毒最常用的兩個包裝系統為哺乳動物人胚胎腎細胞293（HEK29）包裝系統和桿狀病毒/Sf9系統。其中，桿狀病毒/Sf9系統是最早使用的包裝系統之一，可用于生產多種表型的AAV病毒，此系統的包裝成本較低，但病毒衣殼組分極易發生改變、生物效價較差。另外，由于包裝時衣殼基因輔助質粒使用的VP1起始密碼子為非經典的ACG，使得此系統包裝的AAV病毒感染效率較差[11]。然而，考慮到大規模生產的成本問題，桿狀病毒/Sf9系統更適合應用于商業生產中。為了解決其存在的問題，有團隊嘗試對VP1起始密碼子進行替換，但此方法缺乏不同血清型AAV生產所必需的靈活性。ZOLOTUKHIN等人通過篩選效果較弱的KOZAK序列，改變了核糖體掃描起始位點，建立了能夠包裝多種AAV血清型的昆蟲包裝系統，此系統與哺乳細胞包裝系統相比，病毒VP1和VP2蛋白含量大大增加，并且包裝的AAV5病毒 DNA污染率更低、生物效價更優、在小鼠大腦組織中的轉導效率更好[12]。除了對于包裝系統的優化外，衣殼蛋白表達單元的設計對于組裝有效的基因治療載體也至關重要[13]。

3.2 有限的基因組表達效率

應用腺相關病毒載體時發現，它的基因組在核內表達效率十分有限，并且對于某些難轉型細胞，其介導的基因轉導較低，而這可能與其胞內運輸和核內活動有關。據研究報道，細胞中存在一種伴侶蛋白FKBP52，它會在細胞表皮生長因子受體蛋白酪氨酸激酶的作用下，發生酪氨酸或蘇氨酸/絲氨酸磷酸化，在AAV介導外源基因胞內運輸時，磷酸化的FKBP52能使其衣殼表面的酪氨酸殘基磷酸化，衣殼蛋白泛素化水平因此提高，被蛋白酶體識別和降解的概率大大提高，最終外源基因表達效率受到抑制，并且，在細胞核中，磷酸化的FKBP52會與AAV載體基因組3’端的D序列結合，阻礙基因組第二條鏈的合成，從而降低AAV載體介導的基因表達效率[14]。此外，低效率的內含體-溶酶體逃逸過程也可能阻礙其順利完成胞內運輸過程，阻礙基因表達。

3.3 高昂的治療費用

盡管AAV載體藥物在治療某些罕見疾病方面取得了卓越的科學成就，但它的大規模臨床使用和商業開發仍面臨極大挑戰。其中，由于目前AAV病毒包裝系統仍未最優化，并且有限的基因表達效率增大了前期研究和臨床治療中病毒滴度的使用量，使基因治療中AAV載體藥物的價格十分高昂。例如，世界上首個基因治療藥物Glybera。它被用于治療脂蛋白脂肪酶缺乏[15]，由于其高昂的治療費用和較少的市場需求，在歐盟上市期間僅有一名患者接受治療，使其成為歷史上使用者最少的藥物之一，最終被宣布退出市場[16]。因此，實現AAV載體藥物廣泛使用需要調整治療費用和增加患者普及率。然而，這一目標的實現需要有扎實的科研成果支持，因此，提高AAV載體的包裝效率、轉導效率和基因表達效率是解決問題的關鍵。

4 展望

基因治療是人類治療腫瘤、傳染病、遺傳病的新方向。與傳統治療方法相比，它可對疾病進行治療，從根本上起到預防、緩解，甚至根治疾病的作用。AAV載體作為一種低免疫原性的病毒載體，在安全性方面優于其他病毒載體，是目前基因治療領域的研究熱點，并且已開始應用于一些疾病的臨床治療中。

但AAV載體在某些細胞中的轉導效率和基因表達效率仍有待提高。并且，要實現腺相關病毒載體藥物的廣泛使用，還要解決載體的大規模生產問題。然而，隨著人類對AAV研究的深入，其基因組特點和感染機制以及胞內過程越來越清晰，基于此的基因組改造和載體優化越來越成熟，相信在不久的將來，會有越來越多高安全性和兼備有效性的AAV藥物在臨床上市，服務于更多有需要的人群。

［1］WEITZMAN M D，LINDEN R M.Adeno-associated virus biology［J］.Methods in Molecular Biology，2011（807）：1-23.

［2］HUANG L Y，HALDER S，AGBANDJE-MCKENNA M.Parvovirus glycan interactions［J］.Current Opinion in Virology，2014（7）：108-118.

［3］CHATTERJEE S，WONG K K.Adeno-associated virus vectors for gene therapy of the hematopoietic system［J］. Current Topics in Microbiology and Immunology，1996（218）：61-73.

［4］RUSSELL S，BENNETT J，WELLMAN J A，et al.Efficacy and safety of voretigene neparvovec（AAV2-hRPE65v2） in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy：a randomised，controlled，open-label，phase 3 trial［J］.Lancet，2017，390（10097）：849-860.

［5］GAO G，VANDEMBERGHE L H，ALVIRA M R，et al.Clades of adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues［J］.J Virol，2004，78（12）：6381-6388.

［6］YANG Y，WANG L L，BELL P，et al.A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice［J］.Nat Biotechnol，2016，34（3）：334.

［7］ABUDAYYEH O O，GOOTENBERG J S，ESSLETZBICHLER P，et al.RNA targeting with CRISPR-Cas13［J］.Nature，2017，550（7675）：280.

［8］GRIMM D，STREETZ K L，JOPLING C L，et al.Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways［J］.Nature，2006，441（7092）：537-541.

［9］XIE J，MAO Q，TAI P W L，et al.Short DNA hairpins compromise recombinant adeno-associated virus genome homogeneity［J］.Mol Ther，2017，25（6）：1363-1374.

［10］XIE J，TAI PWL，BROWN A，et al.A novel rAAV-amiRNA platform enables potent in vivo gene silencing and a ten-fold enhancement of on-target specificity over conventional shRNA vectors［J］.Mol Ther，2018，26（5）：436-437.

［11］ASLANIDI G，LAMB K，ZOLOTUKHIN S.An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus （rAAV） vectors in insect Sf9 cells［J］.P Natl Acad Sci USA，2009，106（13）：5059-5064.

［12］KONRATOV O，MARSIC D，CROSSON SM，et al.Direct head-to-head evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors manufactured in human versus insect cells［J］.Mol Ther，2017，25（12）：2661-2675.

［13］SNIJDER J，WATERBEEMD M，DAMOC E，et al.Defining the stoichiometry and cargo Load of viral and bacterial nanoparticles by orbitrap mass spectrometry［J］.J Am Chem Soc，2014，136（20）：7295-7299.

［14］ZHONG L，LI B，MAH C S，et al.Next generation of adeno-associated virus 2 vectors：point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（22）：7827-7832.

［15］BURNETT J R，HOOPER A J，ALIPOGENE T.An adeno-associated virus encoding the Ser（447）X variant of the human lipoprotein lipase gene for the treatment of patients with lipoprotein lipase deficiency［J］.Current Opinion in Molecular Therapeutics，2009，11（6）：681-691.

［16］YLA-HERTTUALA S.Bumps in the road for commercial gene therapy for rare diseases［J］.Mol Ther，2017，25（10）：2225.

R450

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.13.066

2095－6835（2020）13－0157－03

譚靚（1995—），女，湖南衡陽人，研究生，研究方向為生物制藥、基因治療。

李泰明（1963—），女，江蘇南京人，博士，副教授，研究方向為生物制藥。

〔編輯：嚴麗琴〕