RNA 干擾技術及其在醫療領域的應用

王宣傲

（北京市順義牛欄山第一中學，北京 101301）

0.引言

20 世紀80 年代，“基因功能及其調控”逐漸成為基因研究的重點。一系列研究結果表明，物種的復雜性與基因組中編碼基因的數量之間沒有相關性：果蠅的編碼基因數量比圓蟲少很多，而水稻植物的基因比人類多。研究人員發現，基因表達調控與物種的復雜性有一定的關系?；虮磉_調控不僅與轉錄、翻譯這些生理過程相關，而且與表觀遺傳調控有一定的關系。不過，當時的科學家尚不清楚基因表達調控的具體機制。

在研究植物的過程中，科學家發現，一些分子量較小的RNA 可以有效地抑制基因的表達，他們將這種現象命名為“有義共抑制”（也被稱為轉錄或轉錄后基因沉默）。更深入的研究表明，與RNA 合成和降解相關的酶與基因沉默息息相關。RNA 依賴RNA 聚合酶（RdRp）可以將有義轉錄本作為模板，產生雙鏈RNA（dsRNA），并觸發RNA 沉默。向細胞中注射反向重復DNA 序列或通過其他方式提高細胞中dsRNA 分子的水平，也會抑制相關基因的表達。這一發現是十分驚人的，因為當時的科學家幾乎從未考慮過，可以通過改變細胞質中特定RNA 的水平調節基因的表達。許多國家的研究人員對這一現象進行了深入的研究，他們發現，在原生生物、絲狀真菌、無脊椎動物以及脊椎動物中，都存在類似的現象。由于這些具有雙鏈結構的RNA 可以干擾基因的表達，科學家將其稱為小干擾RNA（siRNA），將這種干擾現象稱為RNA 干擾。

幾十年來，RNA 干擾領域不斷取得重大進展，科學家設計了許多種含有不同堿基的siRNA，從而提高其在不同環境條件下的穩定性，提高干擾效率。RNA 干擾技術在農業、科研、醫療等領域有著十分廣泛的應用。一些從事生物醫學研究的科學家發現，向人體中注入特定的siRNA，可能有助于抑制某些基因的表達，使患者更快地恢復健康。許多研究人員發現，與反義寡核苷酸相比，siRNA 對核酸酶更具抵抗力，并且治療效果更好。將siRNA 高效地遞送到各種細胞系和原代細胞中后，它們可以高效地發揮作用。將siRNA 注入人體后，siRNA 可以使幾乎任何與疾病相關的靶基因沉默，這為遺傳病和自身免疫病等基因相關疾病的治療提供了新思路。深入分析RNA 干擾技術的研究進展及其在醫療領域的應用，有助于人們更高效地治療一些棘手的慢性遺傳病、慢性傳染病等。

1.RNA 干擾的研究歷史

20 世紀80、90 年代，一些科學家在研究基因的過程中，開展了多項與DNA 和RNA 相關的實驗。一些科學家在研究RNA 的性質的過程中，發現了RNA 干擾現象（RNAi）。研究人員在使用體外合成的RNA 進行反義研究時，發現了與經典的反義抑制理論相矛盾的結果：注射了正義RNA 和反義RNA 的細胞具有相似的表型。Craig Mello 及其同事也在實驗中發現了類似的現象，他們將這種現象命名為“RNA 干擾”（RNAi），以區別于經典的反義抑制。此外，Mello 還注意到這些短鏈RNA 可以擴散到注射部位附近的其他組織，這表明干擾RNA 可以跨越細胞界限，在不同組織間長距離傳遞和維持。不過，當時的科學家無法確定這種現象是由哪種RNA 引起的[1]。

在20 世紀90 年代初，華盛頓卡內基研究所胚胎學系的安德魯·費爾（Andrew Fire）發現雙鏈RNA（dsRNA）可以高效地降解秀麗隱桿線蟲中的特定mRNA，而反義RNA則沒有這種功能。Fire 認為，由于體外合成反應中使用的病毒RNA 聚合酶可以催化多種反應，應用質粒模板進行體外轉錄反應時，體系中可能不僅含有正義RNA 和反義RNA，也含有dsRNA。也就是說，制得的RNA 產物可能是被dsRNA 污染的。Fire 用單鏈RNA（ssRNA）和dsRNA 的純化制備物檢驗了這一假設。用凝膠純化ssRNA 后，注射這些ssRNA 并不能使動物產生相應的表型。他們將正義鏈和反義鏈在體外退火，得到了一些dsRNA，將這些dsRNA 注入動物后，動物體內的一些mRNA 會相對較快地降解，且這種降解具有較高的特異性。這些研究人員還發現，降解最快的mRNA 序列與dsRNA 的正義鏈十分相似[2]。

這些研究表明，dsRNA 可能與mRNA 降解和基因表達調控密切相關，后來，一些科學家對這一現象進行了更加深入的研究。他們發現， dsRNA 分子可以以同源依賴的方式降解靶標mRNA。較長的dsRNA 可被Dicer 酶（一種dsRNA 特異性核酸內切酶）切割，產生長度為21 ～23bp的小干擾RNA（siRNA）。Dicer-siRNA 可以與TAR RNA結合蛋白（TRBP）發生相互作用，并形成RNA 誘導的沉默復合體（RISC），降低特定基因的表達水平。此外，RISC還可以與argonaute 2（Ago2）發生相互作用，后者是一種效應核酸酶，它也可以在5'端切割靶mRNA，使靶mRNA降解為較短的片段，無法翻譯為蛋白質。這些研究結果表明，具有特定序列的雙鏈RNA 可以高效地降解mRNA，干擾基因的表達。后來，生物科學研究者將這類現象統一稱作RNA 干擾[3]。

2. RNA 干擾技術的研究進展

2.1 siRNA 合成

目前，我們通常用化學方法合成siRNA，或者從培養的細胞中提取siRNA。然而，這些siRNA 的干擾效率，有時并不理想。如何改進siRNA 合成技術，是一個十分重要的問題。一些研究人員連接了解旋酶結合組成性轉運元件（CTE）基序和Bcl2 的反義寡核苷酸，并將其導入細胞內，他們發現，與解旋酶偶聯的雜合寡核苷酸的干擾效果更好，雜合寡核苷酸可以更高效地募集細胞解旋酶，并改善寡核苷酸與目標序列的結合情況。

2.2 基于載體的siRNA 表達

用化學方法合成的siRNA 的成本很高，且所合成的siRNA 活性較低。我們可以利用各種啟動子表達盒，將細胞變成siRNA 合成工廠。一些研究人員成功地利用哺乳動物細胞合成siRNA，降低了siRNA 的生產成本。

此外，利用載體生產的siRNA 活性較高，能夠穩定地抑制靶基因的表達。因此，利用這些siRNA，我們可以完成實驗周期較長的基因功能分析。

研究人員常常利用Pol III 啟動子（例如U6 snRNA，H1和tRNA）表達siRNA。首先，在天然狀態下，細胞利用Pol III 啟動子轉錄相對較小的RNA，例如tRNA 和snRNA。其次，Pol III 啟動子在G 或A 處開始轉錄。利用Pol III，我們可以預先確定siRNA 的起始位點，也可以隨時將需要的序列插入轉錄起始位點的下游，從而得到目的產物。此外，利用Pol III，我們可以高效地控制RNA 的聚合過程，只需要向培養基中加入四環素或Cre-loxP，就可以改變細胞中siRNA 的表達水平。因此，我們通常利用這種啟動子，研究瞬時表達基因或致死基因的功能[4]。

目前，可以通過兩種方法，在體內表達特定的siRNA。第一種方法是，采用Pol III 啟動子，指導小的反向重復序列的合成，這些重復序列由可變長度的間隔區隔開，合成的RNA 包含特定的靶序列、環序列（3 ～9nu）和30U 突出端的莖，這些RNA 會在酶的輔助下形成發夾結構。體內的Dicer 酶會進一步加工這些短發夾RNA（shRNA），使其發揮作用。第二種方法是，將兩個U6 啟動子串聯在同一個載體中，或放在兩個單獨的載體中，從而指導靶向序列和含30-UUUU 突出端的小RNA 的轉錄。有義鏈和反義鏈將在體內形成雙鏈體，其功能類似于體外的siRNA。大多數研究表明，這兩種方法都可以產生高活性的siRNA，高效抑制靶基因的表達。不過，在低濃度下，發夾型siRNA表達載體的抑制活性明顯高于串聯型siRNA 表達載體。此外，科學家嘗試對發夾型靶序列進行修飾，這些修飾不影響其活性，但可以提高其在細菌內的穩定性。我們還可以通過其他方法，優化載體結構，從而改變所合成的siRNA的活性。科學家發現，由tRNA（Val）或U6 啟動子驅動的siRNA 的活性存在一定的差異，tRNA-siRNA 的轉錄本比U6-siRNA 更穩定，而且tRNA-siRNA 在Dicer 酶的作用下可以產生更多的siRNA[5]。

一些科學家利用CMV 啟動子，成功地在培養的細胞中合成了有效的siRNA[6]。為了構建該基于Pol II 啟動子的系統，他們將發夾序列引入CMV 啟動子的轉錄起始位點，并使用特定的終止子序列，及時終止轉錄。除Pol III 啟動子外，我們還可以應用其他啟動子（如Pol II 啟動子）合成siRNA。大量研究表明，Pol II（CMV）和Pol III（tRNAVal）特異性啟動子可以成功地抑制哺乳動物細胞中的螢光素酶報告基因。一些科學家開發了載體pDECAP，從而提高siRNA 的表達效率。這種載體可以高效地表達來自RNA 聚合酶II（Pol II）啟動子的長雙鏈RNA（dsRNA）。pDECAP的轉錄本既沒有50 帽結構，也沒有30-poly（A）尾部，轉錄出的dsRNA 可以快速到達細胞質[7]。因此，這種載體可以高效地降低特定基因的表達水平，為研究細胞、組織及整個動物系統中的基因功能提供了新思路。

3. RNA 干擾技術在醫療領域的應用

3.1 治療疾病

應用RNA 干擾技術，醫療工作者可以高效地治療病毒性疾病和腫瘤。雖然目前多數研究僅在哺乳動物細胞系和動物模型中進行，但可以預見的是，隨著RNA 干擾技術的逐步成熟，其必將成為人類戰勝難治性遺傳病、感染性疾病的有力武器。

研究表明，RNA 干擾技術可以在體內有效抑制人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、鼠丙種皰疹病毒和人免疫缺陷病毒的復制。不過，一些病毒可能會迅速地變異，導致導入的siRNA 不能有效地與其結合。

RNA 干擾技術也在腫瘤的治療過程中發揮著重要的作用。許多國家的腫瘤生物學實驗室和生物制藥公司致力于研究siRNA 的功能，并將其作為整體藥物開發策略的一部分。一些研究人員發現，靶向結腸腫瘤細胞系survivin 基因的siRNA 可以抑制腫瘤的生長。這一發現是十分令人興奮的。它可能為治療結腸癌提供新思路。與目前的基因療法臨床試驗相似，在siRNA 治療技術到達臨床試驗階段后，科學家需要采取所有適當的保護患者的措施（如獨立審查、自愿知情同意等），保障患者在接受siRNA 治療過程中的權利。不可置疑的是，前沿的病毒載體傳遞方法是較為有效的，但是如何提高其安全性，避免這些siRNA在進入人體后產生不良反應，是一個頗具挑戰性的問題。

3.2 預防疾病

肉類安全問題一直是人們重點關注的問題。研究表明，牲畜疾病嚴重地威脅著肉類的安全。如何更有效地預防動物患病，控制傳染性疾病的傳播，是農牧業科研人員面臨的重大挑戰。RNAi 技術在疾病的預防中發揮著重要的作用。在研究預防口蹄疫（FMD）的策略以及控制流感病毒H1N1 的方法時，研究人員都需要應用RNA 干擾技術，研究某一干預方法對疾病傳播和動物健康狀況的影響。2014年，一些研究人員通過向受精卵中注射siRNA，成功地獲得了對PRRSV 特異性表達的轉基因(TG)豬，經過TG 豬與NTG 對照發現，體內siRNA 表達使豬血清HP-PRRSV 含量顯著降低 ，并且增加3d 的存活時間，RNAi 技術為家畜抵抗病毒感染提供可能性。

4.結語

RNA 干擾技術是一項十分重要的誘導基因沉默的技術。深入研究其作用機理，實現特定時間內的基因表達調控和組織特異性表達，是未來的主要研究方向。此外，科學家還需對siRNA 在人體中的代謝過程進行深入的研究，從而減輕siRNA 治療的副作用，使其在醫學領域的應用更廣泛。