基于NGF-TrkA通路研究電針療法治療糞失禁兔動物模型的作用機制*

王曉鋒，崔國策，李宇飛，何穎華，智建文，周嬌嬌，李嘉俊,李華山

(中國中醫科學院廣安門醫院,北京 100053)

大便失禁即肛門失禁，為排便功能紊亂的一種癥狀，雖不直接威脅生命，但嚴重干擾患者正常工作和生活，給患者造成生理和心理上的痛苦[1]。流行病學調查顯示肛門失禁發生率在1.4%～18%，而在養老院人群中可達50%[2]。隨著我國人口老齡化加劇，肛門失禁發生率呈上升趨勢，對人類健康造成極大威脅。電針療法是針灸與電刺激兩者結合的綜合方法，具有針對性強、適應證廣、安全性高和醫療成本低的特點，社會反應普遍較好[3]。既往研究報道電針療法對大便失禁有一定改善作用[4]。神經生長因子(Nerve growth factor，NGF)是一種神經細胞生長調節因子，具有促進神經細胞分化、生長的作用[5]。酪氨酸激酶受體A(Tyrosine kinase receptor A，TrkA)是NGF的特異性高親和力受體，介導NGF大多數生物功能[6]。有研究顯示NGF-TrkA信號通路在神經系統病變發生發展過程中發揮重要作用[7]。目前國內有關大便失禁的基礎研究較少，電針療法對大便失禁的具體作用機制尚不清楚。本研究基于NGF-TrkA通路研究電針療法治療糞失禁兔動物模型的作用機制，以期為臨床治療策略提供實驗依據和進一步研究線索，現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

新西蘭兔30只，SPF級，雄性，8月齡，購于深圳康泰生物制品股份有限公司[生產許可SYXK(粵)2018-0193]。將30只新西蘭兔適應性喂養7 d后隨機分為對照組、模型組和治療組，每組10只。

1.2 糞失禁兔動物模型制備

取模型組和治療組新西蘭兔，按30 mL/kg耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(湖北鴻運隆生物科技有限公司)予以麻醉，麻醉成功后固定實驗兔，骶尾部剃毛，常規消毒，取Kimberly-Clark專用穿刺針(上海愛澤工業設備有限公司)于第4薦神經的解剖部位穿刺，穿刺到位后將穿刺針針芯更換射頻針針芯，選擇射頻治療儀(加拿大Baylis公司，型號：PMG-230)按鍵中的CURRENT鍵，增大電流直至實驗兔肛門出現抽搐、收縮，觀察電流值0.6～1.0 mA時開啟熱凝射頻治療模式(時間設定：90 s，溫度設定：85℃)，開始射頻能量傳輸，操作完成后，待射頻針溫度<40℃時再次傳輸射頻能量。術后14 d時測定肛門靜息壓<15 mmHg即為造模成功。

1.3 干預方法

造模成功后，對照組和模型組不作任何干預，治療組采用電針治療。電針治療步驟：針刺雙側中髎(骶部髂后上棘內下方，第3骶后孔處，直刺15 mm)、單側三陰交(后肢內踝尖直上方3 cm處，直刺2 mm)、單側足三里(后肢膝關節前處稍下方，腓骨小頭下2.5 cm，直刺10 mm)，針刺后連接電針治療儀(廣州市美強醫療科技有限公司，型號：XS-998B)，雙側中髎一組，三陰交與足三里一組。刺激參數：持續波，頻率10 Hz，脈寬200 μs，取穴為同一側。隔日治療1次，每次20 min，連續治療3個月。

1.4 評價指標

1.4.1 肛門靜息壓 于治療結束測定各組新西蘭兔肛門靜息壓，操作如下：固定各組新西蘭兔，打開消化道動力測定儀(廣州市瑞橋貿易有限公司，型號：XDJ-S8G)，初始化完成后測壓管道注水、調零，實驗兔肛門內插入測壓管3 cm，按下“取值鍵”讀取數值，緩慢退出測壓管，每隔1 cm讀取數值，共讀取3次，取平均值。

1.4.2 肛門括約肌組織形態學變化 各組新西蘭兔肛門靜息壓測定完成后，處死5只，取其肛門括約肌組織，用10%甲醛溶液(上海鈺博生物科技有限公司)固定，梯度酒精(北京宏昌信科技有限公司)脫水，二甲苯(上海麥克林生化科技有限公司)透明，石蠟包埋成塊，采用組織切片機(上海精密儀器儀表有限公司，型號：McIlwain)切成5 μm連續切片，脫蠟水化，采用HE染色試劑盒(上海威奧生物科技有限公司)染色，流水沖洗，烘片0.5 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠固封劑(天津百倫斯生物技術有限公司)封片，采用光學顯微鏡(北京中西遠大科技有限公司，型號：SH11/YF-9)觀察HE染色結果。

1.4.3 肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達量 HE染色完成后，處死剩余5只新西蘭兔，取其肛門括約肌組織，剪碎，加RIPA裂解液(北京普利萊基因技術有限公司)，置于組織勻漿器(北京海德創業生物科技有限公司)中，10 000 rpm離心5 min，取上清，使用BCA試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司)測定蛋白質濃度。取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉至PVDF膜上，選擇濕轉，TBS-T 25℃封閉1 h，加入NGF一抗(1∶500)(上海優寧維生物科技股份有限公司)、TrkA一抗(1∶300)(湖南遠泰生物技術有限公司)、GAPDH一抗(1∶400)(深圳欣博盛生物科技有限公司)，4℃搖床過夜，PBST洗膜，加二抗(1∶2 000)(武漢愛博泰克生物科技有限公司)，4℃搖床過夜，PBST洗膜，ECL發光試劑盒(上海碩嘉生物科技有限公司)顯色、顯影，以GAPDH為內參蛋白，用Image Quant TL軟件分析各條帶的灰度值。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組新西蘭兔肛門靜息壓比較

模型組新西蘭兔肛門靜息壓顯著低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療組新西蘭兔肛門靜息壓顯著高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療組新西蘭兔肛門靜息壓顯著低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組新西蘭兔肛門靜息壓比較

2.2 各組新西蘭兔肛門括約肌組織形態學變化

對照組新西蘭兔肛門括約肌組織形態結構正常，肌纖維連續完整，括約肌厚度、固有層厚度、肌纖維數量均正常；模型組新西蘭兔肛門括約肌組織形態結構異常，括約肌全層變薄，固有層結締組織變厚，肌纖維數量明顯減少、變細、斷裂，橫紋肌致密程度明顯下降；治療組新西蘭兔肛門括約肌組織形態結構較模型組明顯改善，括約肌全層變厚，固有層結締組織變薄，肌纖維變粗并趨于完整，肌纖維數量增多，橫紋肌致密程度增加。見圖1。

注：A為對照組，B為模型組，C為治療組。圖1 各組新西蘭兔肛門括約肌組織形態學變化(HE染色，100×)

2.3 各組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達量比較

模型組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達量顯著低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達量顯著高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達量顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達量比較

圖2 各組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達量

3 討論

大便失禁是指肛門括約肌對氣體及糞便控制能力減弱或消失，糞便不自主地排泄，至少持續3個月。長期大便失禁會使肛周皮膚受溢出糞便反復刺激，使皮膚處于潮濕和代謝產物侵蝕狀態，造成壓力性潰瘍、會陰部皮炎和骶尾部皮炎等，嚴重影響患者健康水平與生活質量。大便失禁常見病因包括肛門直腸畸形、解剖結構損傷(結腸肛管吻合術、低位前切除術等)、神經系統病變(腦梗死、脊髓結核和運動性共濟失調等)、直腸平滑肌病變和糞便成分異常(腸易激綜合征、感染性腹瀉)等[8]。目前大便失禁治療方法繁多，治療效果尚不確切，作用機制仍不清楚，因此有必要開展基礎實驗研究，為大便失禁發生機理和臨床治療奠定基礎。

電刺激療法是采用低頻脈沖電刺激脊髓神經，使患者恢復身體機能，有效提高生活質量。近年來電刺激療法已廣泛應用于癱瘓、脊柱側凸和胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease，GERD)等疾病[9-11]。針灸是我國特有的治療疾病的手段，為中醫學的一個重要組成部分，主要通過經絡、腧穴的傳導作用達到治療全身疾病目的，其作為補充和替代療法在西方國家也吸引了越來越多的關注[12]。電針療法是針灸與電刺激兩者結合的綜合方法，具有針對性強、適應證廣、安全性高和醫療成本低的特點。有研究證實電針療法具有興奮性和抑制性的雙向調節作用，可通過促進肛門括約肌收縮改善機體排便功能[13]。中醫臨床實踐證實電針療法對脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)后神經源性膀胱有確切療效[14]。本研究選擇主治大小便不利的中髎、三陰交、足三里3個穴位進行電針治療，發現模型組新西蘭兔肛門靜息壓顯著低于對照組，治療組新西蘭兔肛門靜息壓顯著高于模型組，這與既往研究報道一致，提示電針療法對大便失禁有一定改善作用[4]。本研究HE染色顯示治療組新西蘭兔肛門括約肌組織形態結構較模型組明顯改善，括約肌全層變厚，固有層結締組織變薄，肌纖維變粗并趨于完整，肌纖維數量增多，橫紋肌致密程度增加，由此提示電針療法可有效改善大便失禁實驗兔肛門括約肌組織病理改變。NGF是一種神經細胞生長調節因子，具有神經元營養和促突起生長雙重生物學功能，并在中樞及周圍神經元發育、分化、生長和再生過程中有重要的調控作用。此外NGF還能調節免疫系統功能，抑制腫瘤有絲分裂，促進創口組織修復反應。酪氨酸激酶受體(Tyrosine kinase receptor，Trk)由細胞外、跨膜及細胞內三部分組成，具有酪氨酸蛋白激酶活性，其可使位于膜內區段上的酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinase，TPK)激活，使自身肽鏈和膜內蛋白底物中的酪氨酸殘基(Tyrosine residue，PTYR)磷酸化，從而將細胞內信息傳遞到細胞外，導致基因轉錄過程改變及細胞內相應的生物學效應。TrkA是NGF的特異性高親和力受體，能夠介導NGF一系列生物學效應[15]。相關研究表明NGF-Trk A信號通路與腫瘤增殖、血管生成和神經系統生長發育相關[16]。既往研究顯示電針可以促進腦缺血損傷大鼠海馬組織中TrkA表達，從而減少腦缺血誘導的神經元凋亡[17]。本研究顯示模型組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達量顯著低于對照組，治療組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達量顯著高于模型組，電針療法可能通過激活NGF-TrkA信號通路對糞失禁兔動物模型起到改善作用，這可為臨床大便失禁的治療提供新的思路。

綜上所述，電針療法可能通過激活NGF-TrkA信號通路對糞失禁兔動物模型起到改善作用，這可為臨床治療大便失禁提供理論依據。但本研究時間較短，仍有待進一步研究。