RNA 結合蛋白與RNA-蛋白質相互作用的研究進展

賀應蛟，丁 明

（中國藥科大學 生命科學與技術學院，江蘇 南京211198）

在中心法則中，RNA作為連接DNA 與蛋白質的“橋梁”，參與遺傳信息的傳遞與表達，在生物活動中發(fā)揮著必不可少的作用。根據(jù)其結構與功能的差異，將RNA 分為信使RNA（mRNA）、轉運RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）等，現(xiàn)階段研究最為關注的就是mRNA。來源于細胞核內mRNA前體的處理決定了mRNA 運送到胞質后的命運，通過對RNA 的定位來控制基因的表達[1]。mRNA 前體修飾包括5′端加帽、3′端加poly（A）尾、外顯子連接復合蛋白的沉積和剪接過程中內含子的去除等[2]。對mRNA 前體修飾的過程中，RBPs 在細胞核內沉積到轉錄本上決定其最終目的地。RBPs 是一種多功能調節(jié)因子，它們負責處理、定位和控制許多mRNA 的翻譯，改變反式作用RBPs 的表達（如敲低、敲除或過表達）或改變mRNA 靶標中順式作用調控元件會導致發(fā)育或認知缺陷等許多疾病狀態(tài)，RNA-蛋白質相互作用是調節(jié)RNA 水平基因表達的重要檢查點[3]。基因表達的翻譯調控和轉錄水平上的調控一樣重要。mRNA 自身也存在調控區(qū)域[4]，如5′-UTR 與3′-UTR 中序列的改變都會導致疾病的發(fā)生[5]，3′-UTR 通常在細胞質中發(fā)揮作用，但RBP 的結合卻是發(fā)生在細胞核中。RBP 可以與不同的效應蛋白相互作用，另一方面，由于細胞類型和細胞狀態(tài)的不同，使得每個3′-UTR 調控元件都可能執(zhí)行不同的功能，且細胞狀態(tài)也決定了RBP 能否在特定的時間段與mRNA 3′-UTR 結合。除了上面提到的因素，影響RBP 與3′-UTR 結合的原因還包括細胞類型、周圍所處的局部環(huán)境與RNA 的二級或三級結構等[6]。

1 RNA-蛋白質的相互作用

RBPs 和核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）復合物是RNA-蛋白質相互作用的典型功能形式，在轉錄后水平上廣泛控制真核生物中基因的表達[7]。RNA-蛋白質相互作用的研究在多種應用中顯示出實用性，包括評估與人類遺傳疾病中突變RNA 基序的蛋白質結合[8]：急性髓系白血病（Acute Myelocytic Leukemia，AML）的RNA 結合蛋白網(wǎng)絡與磺胺類藥物治療效果評估，以及發(fā)現(xiàn)與寨卡病毒RNA 相互作用的必需宿主蛋白。然而，由于實驗數(shù)據(jù)的有限性，迄今為止，只有少數(shù)代表性物種的部分RBP 得到了較好的研究[9]。

RBP 基因的異常表達和突變會影響RNA 加工的各個步驟，從而改變靶基因的功能。RBP 與多種疾病相關，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病。如導致智力低下最常見的脆性X 綜合征（fragile-X syndrome，F(xiàn)XS）中致病基因FMR1 產(chǎn)生的蛋白FMRP 在其5′UTR 區(qū)發(fā)生突變，從而使CGG 序列重復次數(shù)增加，導致基因啟動子的高甲基化，從而引起轉錄沉默[10]。而在患有共濟失調綜合癥（fragile X tremor ataxia syndrome，F(xiàn)XTAS）的個體中，F(xiàn)MR1 基因并沒有完全沉默。在FXTAS中，延長的CGG 重復被轉錄為FMR1 mRNA 的一部分，此時與CCG重復的RNA相互作用的幾個RBP，包括hnRNPA2/B1 和MBNL，在空間上被隔離在正常位置之外，無法執(zhí)行其正常功能。這些RBPs 功能的喪失導致了FXTAS 的發(fā)生發(fā)展[11]。

在疾病機制的研究方面，WANG等人利用CRISPR/Cas9技術對490 個RBPs 的2 900 個sgRNA 來篩選，發(fā)現(xiàn)CRISPR介導的RBM39 的缺失或藥物降解會導致HOXA9 靶基因的剪接改變，這是AML 必需的轉錄網(wǎng)絡。因此，與其他癌癥相比，導致了AML 細胞的優(yōu)先靶向性。在這過程中，同時發(fā)現(xiàn)了幾個過去從未被描述為與AML維持相關的RBP 不受調控[12]。RNA 結合蛋白RBM39 作為剪切體突變AML 的潛在靶點可被現(xiàn)有磺胺類藥物靶向[13]。鑒于RBM39 在剪接中的機械作用以及DCAF15 銜接蛋白對磺胺類藥物活性的需求，確定了剪接體基因突變的存在和DCAF15 表達水平都是對磺胺類藥物反應的重要預測因子[12]。

此外，在眾多以RNA 為主要遺傳物質的生物中，絕大部分是病毒，如煙草花葉病毒、艾滋病病毒（HIV）、流感病毒等，而RBP 在其生命活動周期中發(fā)揮著舉足輕重的作用。如寨卡病毒（ZIKV），其遺傳物質是單股正鏈RNA（+ssRNA）的有包膜病毒，主要通過節(jié)肢動物伊蚊（Aedes）傳播（蟲媒病毒）[14-15]。病毒顆粒中的遺傳物質侵入宿主細胞后，正鏈RNA 發(fā)揮類似于mRNA 功能的作用，利用宿主提供的原料合成自身編碼的蛋白質，其中包括RNA 復制酶、衣殼蛋白等，并在新合成的RNA 復制酶作用下以正鏈RNA為模板合成雙鏈RNA，隨后雙鏈RNA 在解旋酶的作用下，正鏈脫離負鏈，與之前合成的衣殼蛋白等裝配并釋放，負鏈則基序作為模板不斷合成正鏈。即便是了解了病毒的復制過程，但其免疫和發(fā)病機理還是未知。

2 RNA-蛋白質相互作用研究方法

研究mRNA 與特定RBP 相互作用的生物化學方法過去通常依賴于SELEX 法、凝膠阻滯實驗（EMSA）、紫外交聯(lián)（UV cross-linking）、免疫沉淀（IP）或/和親和純化技術（Affinity purification）[2-3]。目前用于研究RNA 與其相互作用蛋白的主流方法有APEX、BioID 等，已經(jīng)有研究者對這些方法進行過歸納與總結[16]。

用于研究胞內RNA 追蹤方法如下：①原位雜交。即RNA-FISH，反義寡核苷酸帶有放射自顯影標記，如3H 或32P，可以靶向其特異的DNA 或RNA 序列。②分子信標（molecular beacons）。與FISH 原理相同，可檢測固定的和活細胞中的RNA。③MS2 標記。將帶有MS2 噬菌體莖環(huán)標記的待研究RNA 與融合有熒光報告蛋白的MS2 衣殼蛋白共同表達，檢測細胞內熒光信號。④Cas-derived systems。基于CRISPR/Cas 技術，熒光探針標記的dCas 蛋白靶向與sgRNA 序列結合的目標RNA，通過檢測活胞內熒光信號追蹤目標RNA。

2.1 基于BioID 方法

2.1.1 BioID

BioID （ proximity-dependent biotin identification）由DamID 發(fā)展而來，在原核細胞中Dam 甲基化酶與潛在的DNA 結合蛋白融合，當融合蛋白在真核細胞中表達時，它將與之接觸的DNA 序列特異性的甲基化留下相互作用的化學痕跡[17]。BioID 是基于一個突變的BirA 產(chǎn)生的混雜的生物素化[18]。BirA*是一個35KD 大小來源于大腸桿菌的DNA結合生物素蛋白連接酶，可調節(jié)乙酰輔酶A 羧化酶亞基的生物素化，并作為生物素生物合成操縱子的轉錄抑制子。在這個系統(tǒng)中，生物素受體標簽（BAT）與感興趣的蛋白融合，并與BirA 共表達，使BAT 序列被生物素化[17]。體內鄰近標記可成功識別已知的蛋白質-蛋白質和蛋白質-RNA 相互作用。在DamID 基礎上，人們又對此方法進行改進，將鏈霉親和素單體突變融合到感興趣的蛋白質上，在其附近招募一個包含生物素和光活化基團的小的化學探針。NHS 活化的生物素可以標記多肽鏈N 端和側鏈上賴氨酸殘基中含有的氨基（-NH2）。通過365 nm 波長的紫外激活光化學基團與附近分子迅速且不可逆地發(fā)生反應，使細胞內的蛋白質和RNA 生物素化[19]。對于大的蛋白質，標記幾個賴氨酸殘基和N 端通常不會影響蛋白功能或其結合特性；但對于短肽來說，隨機的生物素化可能會阻塞生物素化蛋白下游活動所必須的結合位點，改變其功能特性。

2.1.2 工程化抗壞血酸過氧化物酶

工程化抗壞血酸過氧化物酶（engineered ascorbate peroxidase，APEX）的原理與方法是用過氧化氫（H2O2）將活細胞處理1 min，APEX 催化生物素-苯酚的單電子氧化，生成壽命非常短的生物素苯氧基自由基[20]。該自由基共價標記APEX 附近的內源蛋白質，從而允許其隨后使用鏈霉親和素磁珠進行富集并通過質譜鑒定[21]。由于APEX 缺乏二硫鍵和鈣結合位點，因此可以在還原性細胞質環(huán)境中表達而不會喪失活性。通過對APEX 的改進，在生物素-苯酚存在的情況下，APEX2 中的A134P 突變可改善動力學、熱穩(wěn)定性，且對高H2O2濃度具有抗性[22]，相對減少對細胞的損傷。

2.1.3 RNA-蛋白質相互作用檢測

RNA-蛋白質相互作用檢測（RNA-protein interaction detection，RaPID）是通過改造枯草芽孢桿菌中的BirA，稱為BASU，可用于直接研究完整活細胞中特定RNA 與蛋白質的相互作用，且更適合研究長度小于132 nt 的基序[23]，所以在研究短RNA 序列時可能特別有用[8，24]。

2.2 非BioID 方法

2.2.1 MS2 標記

MS2 標記是一種體內RNA 標記方法，用于跟蹤活細胞內RNA 的原始技術。來源于噬菌體ssRNA，它與原核生物和真核生物中內源性的RNA-蛋白復合物正交[25]，最初被稱為MAPS。MS2 標簽被噬菌體MS2 衣殼蛋白（MS2 coat protein，MCP）特異性識別，該蛋白再與MS2 結合蛋白（MS2 binding protein，MBP）融合，因為MBP 本身能與直鏈淀粉樹脂結合，可以特異性保留含有修飾的MS2-sRNA 復合物[26]。而Robert Singer 使用GFP 作為熒光報告分子將GFP與MS2 衣殼蛋白結合，即融合了熒光蛋白的MS2 外殼蛋白（MCP-FP）能與攜帶有RNA 序列的MS2 結合位點（MS2 binding site，MBS）結合，作為捕獲RNA 和RNA 結合蛋白的一種方式[27]。通過將GFP 與這種MS2 蛋白融合，通過熒光顯微鏡觀察可以在細胞內遷移時跟蹤RNA[28]。MS2 可插入mRNA 的3′-UTR 或5′-UTR，但MCP 與5′-UTR 的MBS結合會降低標記mRNA 的翻譯效率[25，29-31]，且3′UTR 含有更少的進化保守區(qū)域，更適合位點的插入[25]。MCP 二聚化是與MBS 結合的先決條件[32-33]。

2.2.2 PUP-IT

PUP-IT（Pupylation-based interaction tagging）是一種新的近似標記系統(tǒng)，利用細菌Pup 蛋白偶聯(lián)系統(tǒng)，將編碼Pup連接酶的pafA 基因與誘餌蛋白進行融合。Pup 是一種小型細菌蛋白，包含了C 端為Gly-Gly-Gln 的共計64 個氨基酸。在細菌中，C 端的Gln 首先脫氨基為Glu，這種形式的Pup被稱為Pup（E）。在ATP 存在下，Pup 連接酶PafA 催化Pup（E）上C 端的Glu 磷酸化，然后將C 端的Glu 連接到目標蛋白賴氨酸殘基側鏈上。這個過程與真核生物泛素化過程相似，賴氨酸的ε-氨基是反應所必須的。PafA 介導底物上的Pup 修飾。Pup（E）與底物賴氨酸的連接與主序列無關。

與BioID 和APEX 不同，BioID 和APEX 都依賴于活化的底物和標簽蛋白在相對半徑內的自由擴散，PUP-IT 使被激活的Pup 與酶結合，并以更有限的標記半徑運行。在體外和細胞中，PUP-IT 比BioID 更活躍，沒有APEX 那么活躍（APEX 標記約1 min），因此可能不適用于研究快速信號轉換中的蛋白質與蛋白質相互作用。但PUP-IT 和APEX 都可以用于細胞外標記。但因為Pup 不能在細胞膜上擴散，因此PUP-IT 不適用于研究細胞器內部的相互作用。PUP-IT 與其他近似標記系統(tǒng)互補[34]。

2.2.3 XRNAX

蛋白質交聯(lián)RNA 的通用純化方法提取的樣品中包含所有主要生物類型的RNA，主要是通過紫外交聯(lián)細胞，用TRIZOL 法提取并收集TRIZOL 中間相，將其洗滌以去除游離的未交聯(lián)的蛋白質和RNA，并經(jīng)DNA 酶消化以去除DNA，從而得到高濃度RNA 和蛋白質，再通過測序與質譜進行后續(xù)檢測[35]。除了UV cross-linking，與紫外交聯(lián)不同，甲醛作為一種可逆交聯(lián)劑，經(jīng)常作為固定劑以保持細胞結構的完整性。以甲醛作為交聯(lián)劑，利用核糖核蛋白免疫沉淀反應（RNP immunoprecipitation，RIP）的方法研究體內RNA-蛋白質的相互作用，利用特異性抗體通過免疫沉淀從細胞中分離RNA-蛋白質復合物[36]。

2.2.4 點擊化學輔助RNA 內酯捕捉技術

點擊化學輔助RNA 內酯捕捉技術（click-chemistryassisted RNA interactome capture，CARIC）使用炔基尿苷類似物對RNA 進行代謝標記，使RNA 的捕獲不依賴于poly（A）[23]。

3 結語

縱觀目前的研究現(xiàn)狀，已經(jīng)有越來越多的RNA 相互作用蛋白的功能被發(fā)現(xiàn)，也有更多的研究人員著眼于這一關鍵方向。雖然蛋白質-蛋白質相互作用的研究方法已經(jīng)趨于成熟，也有許多新的技術出現(xiàn)并用于研究RNA 與蛋白質的相互作用，但這些方法與目前的研究現(xiàn)狀仍不能滿足對于未知領域與方向的開發(fā)需求，上述每一種研究RNA 與蛋白質相互作用的方法都需要和其他方法聯(lián)合使用來達到最佳的效果。也只有在方法優(yōu)化的基礎上，才能發(fā)現(xiàn)更深層的RNA與蛋白的互作關系網(wǎng)絡，并不能僅從單一的方面來決定某一種研究方法的優(yōu)劣。

對于標記方法的靈敏度而言，APEX 明顯優(yōu)于PUP-IT，而PUP-IT 又優(yōu)于BioID，但APEX 由于苯酚與過氧化氫的加入而使得其細胞毒性增加，即使改進后的APEX2 已經(jīng)對這一點作出優(yōu)化，但該問題仍無法避免。而PUP-IT 目前的研究顯示并不適用于細胞器內部相互作用研究，BioID/BioID2 雖然用途廣泛，但對于短肽卻仍然存在缺陷。對于RNA-蛋白質交聯(lián)來達到純化RNA-蛋白質復合物的方法，即使是可逆的甲醛，仍然會對細胞膜產(chǎn)生損傷。因此如何發(fā)揮各方法的優(yōu)點或開發(fā)更多的方法對RBP 的研究尤為重要。隨著多組學與質譜技術的發(fā)展與聯(lián)合應用，過去由點至面的研究方法逐漸向更深入和精細的方向發(fā)展，并推動人們對RBP 蛋白在體內的功能以及分子機制的理解。