細(xì)胞外基質(zhì)因子誘導(dǎo)血管化組織工程膜修復(fù)半月板損傷研究

楊業(yè)靜 ，李興艷，李林，梁紅鎖，黃家志，楊丹凌，杜勇軍?

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530031；2.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 南寧 530000）

0 前言

半月板是位于股骨內(nèi)側(cè)和膝脛骨平臺之間的兩個纖維軟骨組織，由纖維軟骨組成，內(nèi)外各有一塊。半月板主要起到穩(wěn)定關(guān)節(jié)、增加關(guān)節(jié)的吻合度等作用，是膝關(guān)節(jié)運(yùn)動必不可少的一部分。隨著社會人口老齡化的步入、人民生活水平的提高及人民不良生活飲食習(xí)慣的突出，肥胖導(dǎo)致的膝關(guān)節(jié)半月板損傷是骨科常見疾病。半月板損傷的處理，臨床上治療常規(guī)是在關(guān)節(jié)鏡下予以部分切除修復(fù)或半月板縫合，嚴(yán)重者則予以半月板全部切除，早期治療效果比較滿意，可在一定程度上減輕患者的膝關(guān)節(jié)局部疼痛、腫脹，但長期則可能產(chǎn)生關(guān)節(jié)僵硬、肌肉萎縮、失用性萎縮及膝關(guān)節(jié)退行性改變等疾病，甚至導(dǎo)致軟骨及軟骨下骨壞死骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，給患者帶來了極大的痛苦及生活壓力及大幅度降低了患者的生活質(zhì)量[1]。因此，從一定程度上講，膝關(guān)節(jié)半月板損傷的處理仍然是骨科疾病中研究的一大難題[2]。同時，隨著異體組織移植的興起，異體或異種半月板移植成為修復(fù)半月板損傷可能，但供體組織貨源少及組織排異等現(xiàn)象出現(xiàn)了較多的移植術(shù)后并發(fā)癥。此外，目前的外科治療還不能有效的解決半月板損傷后修復(fù)的問題。近年來，隨著組織工程及干細(xì)胞轉(zhuǎn)化再生的廣泛引用，干細(xì)胞聯(lián)合組織工程構(gòu)建人工半月板組織移植成為修復(fù)半月板損傷的研究熱點(diǎn)[3]。

對于人工半月板組織原材料的研究，較多的是使用胚胎干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、小腸黏膜下層和內(nèi)皮細(xì)胞等作為種子細(xì)胞定向分化的研究[4]。眾所周知，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synovium-derived stem cells，SDSCs）是指來自于膝關(guān)節(jié)滑膜的間充質(zhì)干細(xì)胞。此外，目前尚未有關(guān)于將SDSCs 作為種子細(xì)胞構(gòu)建完整半月板組織的相關(guān)報道。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果及大量的前人研究報道。目前已經(jīng)證實(shí)SDSCs 能通過體外誘導(dǎo)體系從而生成較成熟且均質(zhì)的軟骨樣組織。然而，SDSCs 的體外軟骨樣組織誘導(dǎo)體系能否在體外成功構(gòu)建出類似原生態(tài)且體積較大的人工半月板形軟骨樣組織有待學(xué)者們的深入研究。

在我們的實(shí)驗(yàn)研究中，首先，我們應(yīng)用兔SDSCs和兔頸靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞為本次實(shí)驗(yàn)的人工種子細(xì)胞，同時聯(lián)合小腸黏膜下層支架材料，擬在體外構(gòu)建完整的具有一定力學(xué)強(qiáng)度且成熟軟骨組織形態(tài)的人工組織工程化半月板。并將其植入半月板損傷區(qū)。隨后，在本實(shí)驗(yàn)中，我們對所有新西蘭大白兔進(jìn)行單獨(dú)飼養(yǎng)，并分別于第4、8、12、16 周時采用人工化、理性化方式處死大白兔后取出新形成的人工半月板。最后，我們采用阿爾新藍(lán)比色法檢測糖胺多糖（GAG）含量，同時觀察其組織大體形態(tài)及生物力學(xué)及作為評估指標(biāo)了解半月板損傷修復(fù)情況。進(jìn)而深入探討細(xì)胞外基質(zhì)因子誘導(dǎo)血管化組織工程膜修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)半月板損傷的潛能及可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SDSCs 的獲取及分離培養(yǎng)

首先，在無菌條件下獲取健康新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織后，將其加入10mL 的DMEM 培養(yǎng)基的100mm 培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)皿中含2mg/mL II 型膠原酶及20%FBS），隨后于5%C02培養(yǎng)箱中消化過夜(約14小時)。同時，過濾提取原代細(xì)胞，繼而接種到25 mL 塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)放入培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。經(jīng)3d 半量換液、5d 全量換液后每3 天換液一次，細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底面積后予以消化、傳代，在倒置顯微鏡下觀察。以第3 代SDSCs 作為種子細(xì)胞待用。新西蘭大白兔來自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室中心，胎牛血清購自美國Gibco 公司。

1.1.2 血管內(nèi)皮細(xì)胞的獲取及分離培養(yǎng)

首先，我們在無菌條件下獲取來自健康新西蘭大白兔的頸靜脈血管組織，并將注射器的灌注針頭穿入靜脈一端，用PBS 向靜脈腔內(nèi)反復(fù)注射沖洗已獲得的頸靜脈血管組織，繼而將靜脈內(nèi)的殘留成分沖洗干凈。隨后，我們?nèi)∠伦⑸淦鞑⒊槲还芸諝?，目的是將空氣注人靜脈腔內(nèi)從而使管腔內(nèi)的PBS 全部排出。接著，我們再用注射器抽吸一管0.259 毛膜蛋白酶液，將其緩慢推注至靜脈腔中，待另一端有少量酶液流出時，迅速結(jié)扎有酶液流出的靜脈端，繼續(xù)向靜脈腔內(nèi)注入膜蛋白酶液，直到靜脈管壁微微充盈鼓起，結(jié)扎灌注針頭端的靜脈。最后，我們將兩端結(jié)扎的靜脈置人一盛有PBS 的培養(yǎng)皿中，放入37 ℃、5%C02的陪養(yǎng)箱中孵育25 分鐘，繼而剪斷靜脈兩側(cè)的結(jié)扎線，放出消化液，并用另一帶灌注針頭的注射器注人含20%胎牛血清的 M199 培養(yǎng)液，邊沖洗邊中止消化。最后，實(shí)驗(yàn)人員收集消化液，并置于離心機(jī)中離心 5 min；棄上清液，用20%M199 培養(yǎng)液將沉淀的細(xì)胞制成懸液，以1.5×105個/mL 接種于培養(yǎng)板中；繼而置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，12 h 后進(jìn)行首次換液，以后隔日換液，倒置顯微鏡下每日進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，作為種子細(xì)胞備用。

1.1.3 人工半月板組織的構(gòu)建

首先，我們選取豬空腸脫細(xì)胞的SIS 材料作為實(shí)驗(yàn)使用的支架(新鮮的豬空腸組織從市場購買，具體的分離提取方法見文獻(xiàn))[5]，并將血管內(nèi)皮細(xì)胞和異體兔SDSCs 作為種子細(xì)胞種植在已獲得的載體材料上，隨后在三維條件不同培養(yǎng)基下聯(lián)合培養(yǎng)3周，構(gòu)建血管化組織工程半月板膜，并將組織工程半月板膜多層折疊、修剪整齊至長寬分別約0.4 cm、0.2 cm大小的半月板組織，待以備用。本實(shí)驗(yàn)研究以廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供的20 只新西蘭大白兔為動物模型，體重約為2.0-2.4 kg；新西蘭大白兔包括9 只雄性和11 只雌性。

1.2 方法

本實(shí)驗(yàn)共選取上述的20 只健康的新西蘭白兔作為實(shí)驗(yàn)動物。將其固定在手術(shù)臺上，并在耳靜脈進(jìn)行靜脈全麻(2%戊巴比妥鈉，約2mg/kg)。常規(guī)消毒及鋪巾后，以膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)及外側(cè)弧形切口為手術(shù)入路，雙側(cè)膝關(guān)節(jié)同時手術(shù)。首先，沿著髕骨上緣到脛骨結(jié)節(jié)內(nèi)側(cè)進(jìn)行約0.8 厘米長的皮膚切口。仔細(xì)操作，皮膚、皮下組織和筋膜依次分層切割，以防止對膝關(guān)節(jié)表面軟骨的損傷。隨后，內(nèi)側(cè)半月板前后角、體部和股髁軟骨表面完全暴露，半月板被挑起，整個半月板損傷模型是在內(nèi)側(cè)半月板的前角用鐮刀刀片制作的，損傷處稍微靠近內(nèi)側(cè)半月板的中心。整個操作過程謹(jǐn)慎操作，以防止損傷半月板下軟骨。同時，雙膝關(guān)節(jié)外側(cè)半月板造模操作步驟如同內(nèi)側(cè)半月板損傷造模。完成新西蘭大白兔雙膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)半月板損傷造模（80 個半月板）時將其（左外、左內(nèi)、右內(nèi)、右外）隨機(jī)分為4 組（A 組、B 組、C 組、D 組，20 只健康體質(zhì)新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)半月板四組之間的分組差異無統(tǒng)計學(xué)意義）。A 組植入血管化培養(yǎng)后的人工半月板組織，整齊對合，然后用5-0的可吸收縫線縫合固定；B 組植入未血管化培養(yǎng)的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞-小腸黏膜下層復(fù)合材料，C 組僅植入小腸黏膜下層支架材料，D 組則為自發(fā)修復(fù)空白對照。隨后逐層縫合皮下組織、皮膚。所有新西蘭大白兔均予單籠飼養(yǎng)。后分別于術(shù)后4周、8 周、12 周、16 周處死大白兔并取材（每次5 只，每只均包括A、B、C、D 四組半月板，共20 個半月板），取材時采用大體形態(tài)學(xué)觀察，并取同等大小的再生組織后采用生物力學(xué)測定不同組別彈性模量及采用阿爾新藍(lán)比色法檢測糖胺多糖（GAG）平均含量作為評估指標(biāo)評價半月板損傷修復(fù)情況，見圖1。

圖1 兔膝關(guān)節(jié)囊顯露半月板取材

1.3 觀察指標(biāo)

①半月板取材后采用大體形態(tài)學(xué)觀察時，A 組應(yīng)注意觀察人工半月板植入物的顏色、大小、質(zhì)地，同時觀察其與正常半月板的銜接是否完整，并仔細(xì)觀察植入的人工半月板與周圍正常半月板的差異如光滑度等差異；B 組和C 組應(yīng)注意觀察是否萎縮、是否有再生組織，若有，則觀察再生組織的顏色、大小、質(zhì)地，并與正常半月板的差異；D 組應(yīng)注意觀察半月板造模缺損處是否增大，是否有再生組織，若有，則觀察再生組織是否向中心靠攏，并觀察其與周圍正常半月板組織的差異。此外，還要注意觀察與之接觸的周圍韌帶和軟骨的變化，是否有韌帶損傷即周圍軟骨軟化等情況。在做大體觀察形態(tài)學(xué)比較時，比較同一時期取材的不同組再生組織的形態(tài)學(xué)變化，同時比較同組再生組織不同取材時期的形態(tài)學(xué)變化。②切取修復(fù)再生組織標(biāo)本作彈性模量測定時，比較同體異組半月板彈性模量平均值的變化，同時比較同組異體半月板不同時候的彈性模量平均值的變化。③采用阿爾新藍(lán)比色法檢測再生半月板組織糖胺多糖（GAG）含量以評估半月板損傷修復(fù)情況，見圖2。

圖2 半月板組織大體形態(tài)學(xué)觀察

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，計量資料數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。用卡方檢驗(yàn)對計數(shù)資料數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水平a=0.05，P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

所有實(shí)驗(yàn)動物新西蘭大白兔均存活良好，此次觀察指標(biāo)一共是80 個半月板組織，但有一只新西蘭大白兔右膝部外側(cè)傷口發(fā)生感染，有一只新西蘭大白兔左膝關(guān)節(jié)活動較差，發(fā)生攣縮，因此，這兩只新西蘭大白兔的所有半月板組織則不納入觀察對象。其他新西蘭大白兔的傷口均愈合佳，膝關(guān)節(jié)活動可。所以，在本實(shí)驗(yàn)中，最終觀察的半月板一共為72 個（A、B、C、D 四組均為18 個）。我們采用了大體形態(tài)學(xué)觀察，并取同等大小的再生組織后采用阿爾新藍(lán)比色法檢測GAG 平均含量及采用生物力學(xué)測定不同組別彈性模量平均值作為評估指標(biāo)評價半月板損傷修復(fù)情況。其結(jié)果如下。

2.1 大體形態(tài)學(xué)觀察

（1）A 組：術(shù)后4 周示人工半月板組織與周圍正常半月板銜接良好，周圍空隙逐漸愈合，植入的人工半月板組織質(zhì)地較前稍韌；術(shù)后 8 周示人工半月板組織與周圍正常半月板邊界較模糊，周圍空隙進(jìn)一步變小，空隙處逐漸被白色新生組織充填，愈合良好，質(zhì)地較韌；術(shù)后12 周示周圍空隙缺損處已完全被白色半月板樣組織所替代，但表面較粗糙，仍較易與周圍正常半月板組織辨別；術(shù)后16 周示人工半月板與周圍正常半月板組織銜接處的再生組織表面光滑，幾乎沒有差別，難以分辨。（2）B 組：術(shù)后4 周示人工半月板組織與周圍正常半月板銜接缺損處有部分組織充填，表面柔軟，但其體積較小，仍留有較大空隙；術(shù)后8 周示缺損修復(fù)區(qū)縮小，缺損區(qū)大部分已被纖維性組織所替代，表面不光滑；術(shù)后12 周示缺損處可見白色纖維疤痕樣組織，并可見橫行或縱行缺損；術(shù)后16 周示缺損處已完全被再生組織替代，但表面無A 組16 周時光滑。（3）C 組：術(shù)后4 周示缺損處可見部分組織充填，柔軟，小腸黏膜下層支架存在，但其體積較前明顯縮??；術(shù)后8周缺損修復(fù)區(qū)小腸黏膜下層支架材料均完全消失，缺損區(qū)大部分已被纖維性組織所替代；術(shù)后12 周可見白色纖維疤痕樣組織，并可見橫行或縱行缺損。（4）D 組：術(shù)后4 周示缺損清晰可見，未見明顯新生組織生成；術(shù)后8 周示缺損處明顯，底部形成少量白色膜狀組織；術(shù)后12 周，缺損明顯，無明顯修復(fù)跡象，缺損底部有少量纖維組織形成，界限明顯；術(shù)后16 周示正常半月板中心萎縮，空隙缺損處較前變大。

2.2 彈性模量測定

生物力學(xué)彈性模量測定結(jié)果顯示4 組半月板組織的彈性模量隨時間而逐漸增加，A 組半月板4 周、8 周、12 周、16 周的彈性模量分別是：（39.26±1.74）Mpa、（71.09±2.18）Mpa、（99.38±1.98）Mpa、（105.64±3.41）Mpa；A 組標(biāo)本4 個時間點(diǎn)彈性模量平均值間比較和與其他三組彈性模量平均值之間的比較具有統(tǒng)計學(xué)差異，如表1。

表1 半月板彈性模量的測定 (Mpa，)

表1 半月板彈性模量的測定 (Mpa，)

2.3 GAG 含量測定

阿爾新藍(lán)比色法檢測再生半月板組織糖胺多糖（GAG）含量結(jié)果顯示4 組半月板GAG 含量均隨著時間的增加而增高；在同一時期不同組GAG 含量的差異性比較具有統(tǒng)計學(xué)意義；如表2。

表2 兔半月板GAG 含量的測定(ug/mL，)

表2 兔半月板GAG 含量的測定(ug/mL，)

3 討論

膝關(guān)節(jié)半月板是膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的重要組件，對減緩重力對脛骨平臺的壓迫及促進(jìn)膝關(guān)節(jié)屈伸活動具有重要作用。同時，半月板因其血運(yùn)差等解剖特點(diǎn)而損傷后難以愈合[6]。因此，對于膝關(guān)節(jié)半月板的損傷，應(yīng)盡量予以修復(fù)以防止后期膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。目前對于半月板損傷的治療，主要在于外科手術(shù)對其進(jìn)行手術(shù)修縫合或部分切除，而術(shù)后引發(fā)的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[7]。

隨著干細(xì)胞分化機(jī)制及組織移植組織工程研究的興起，已有部分研究將膝關(guān)節(jié)半月板損傷的治療朝向干細(xì)胞分化軟骨細(xì)胞及軟骨組織移植上；如張慶金等人為研究骨關(guān)節(jié)炎的治療方式時發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可定向分化為軟骨細(xì)胞[8]；亦如脂肪干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞的軟骨分化等[9-11]。這些學(xué)者們將干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為軟骨細(xì)胞后，聯(lián)合細(xì)胞外基質(zhì)支架，再植入半月板缺損處，以此來修復(fù)損傷的半月板。

在本研究中，我們利用兔SDSCs 與血管內(nèi)皮細(xì)胞為種子細(xì)胞，聯(lián)合小腸黏膜下層（SIS）支架材料三維條件下誘導(dǎo)血管化培養(yǎng)成人工半月板組織材料，隨后植入損傷的半月板組織，探討細(xì)胞外基質(zhì)因子誘導(dǎo)血管化組織工程膜修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)半月板損傷的潛能及可行性。我們通過血管化的人工半月板組織材料與未血管化培養(yǎng)的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞-小腸黏膜下層復(fù)合材料、小腸黏膜下層支架材料及自發(fā)修復(fù)之間的比較，確定了血管化培養(yǎng)的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞-小腸黏膜下層復(fù)合材料植入半月板損傷處后，其修復(fù)程度及速度均較其他對照組佳，有助于成功構(gòu)建具有精確形態(tài)的組織工程化半月板。

此外，目前對于干細(xì)胞分化結(jié)合人工半月板移植，較多的層面還停留在單純簡單的單細(xì)胞分化，未涉及到半月板組織的血管化組織工程[12]。這類人工半月板組織雖然能簡單的替代半月板組織，具有了半月板軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，但對于半月板組織的血管化來說，還有待進(jìn)一步的探索，有導(dǎo)致后期的半月板軟骨細(xì)胞壞死等的可能[13-14]。而我們的實(shí)驗(yàn)研究則是將SDSCs 和血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合作為種子細(xì)胞，聯(lián)合小腸黏膜下層支架材料在三維條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3 周后，可見明顯的血管化組織。我們將其植入半月板損傷處后通過GAG 含量測定均與正常半月板相近，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均證明了人工復(fù)合物組織已構(gòu)建成完整的具有一定力學(xué)強(qiáng)度且成熟軟骨組織形態(tài)的人工組織工程化半月板，且殘存的未降解材料量較少。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種實(shí)驗(yàn)方案保證了軟骨的良好形成及降低了回植體內(nèi)后的炎癥反應(yīng)。此外，生物力學(xué)測試結(jié)果表明，血管化人工半月板的彈性模量較高，更接近正常人的半月板。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)在以SDSCs 與血管內(nèi)皮細(xì)胞為種子細(xì)胞，聯(lián)合小腸黏膜下層支架材料三維培養(yǎng)時，SDSCs 與血管內(nèi)皮細(xì)胞相容性、相鄰細(xì)胞貼靠小腸黏膜下層支架交織生長。A 組毛刺狀突起明顯多于其他對照組，B 組可見少許毛刺狀突起，證實(shí)了A 組血管化明顯高于其他各組，這提示血管化后的人工半月板組織更有利于損傷半月板的修復(fù)。

綜上所述，本研究證實(shí)了SDSCs 具有軟骨細(xì)胞分化能力，并與血管內(nèi)皮細(xì)胞相容性較好；同時證實(shí)了血管化后的人工半月板組織較單一的人工半月板組織更能修復(fù)半月板的損傷。本實(shí)驗(yàn)不僅為細(xì)胞治療的臨床轉(zhuǎn)化研究提供了一定的理論基礎(chǔ)，而且為以后半月板修復(fù)方法研究鑒定了良好的基礎(chǔ)。具有一定的借鑒意義。

4 結(jié)論

以小腸黏膜下層為支架材料，以滑SDSCs 和內(nèi)皮細(xì)胞為種子細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增及細(xì)胞因子刺激血管化培養(yǎng)后的再生組織，植入兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)修復(fù)半月板局部缺損的方法，具有一定的借鑒意義。