蜂膠乙醇提取物通過p38 MAPK/NOX4信號通路對1型糖尿病大鼠腎臟的保護作用

羅影，左中夫，張俏，薛坤，劉暢，閔連秋

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）多發于兒童和青少年，其發病機制復雜，隨著病程的延長，多引起糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）［1］。DN為T1DM患者死亡的主要原因。T1DM患者發生DN多與遺傳和環境因素有關，但僅僅針對以上因素并不能完全阻止DN的發生。氧化應激可使糖尿病患者機體代謝紊亂［2］，從而引起活性氧異常增加，為DN發病的重要原因［3］。通過抑制T1DM小鼠氧化應激反應可明顯減輕其引起的DN損傷［4］。蜂膠乙醇提取物（ethanol extract of Chinese propolis，EECP）富含黃酮類物質，是一種天然的抗氧化劑［5］。研究發現，EECP能降低血糖并發揮抗氧化功能［6］。EECP可直接調節糖尿病大鼠血糖，同時也可降低丙二醛（MDA），提高超氧化物歧化酶（SOD），對抗視網膜氧化應激損傷［7］。然而，EECP對T1DM大鼠腎臟的影響及作用機制尚不清楚。本研究通過鏈脲佐菌素（STZ）制備T1DM模型，對大鼠進行灌胃治療，進而探討EECP對T1DM大鼠腎臟的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑儀器SPF級雄性SD大鼠68只，6周齡，體質量180～220 g，購自錦州醫科大學，編號：SCXK（遼）2009-2017。STZ購自美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍（施貴寶制藥公司，規格0.5 g/片）；EECP（西安西海生物科技公司，純度98%）；NADPH氧化酶4（NOX4）一抗（兔抗鼠）、pp38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）一抗（兔抗鼠）、p38 MAPK一抗（兔抗鼠）購自英國Abcam公司；MDA、SOD含量檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；HE染色試劑盒及Western blot山羊抗兔二抗購自北京碧云天公司。倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；石蠟切片機（德國SLEE公司）；水平電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型制備大鼠采用單次腹腔注射質量分數為1.5%的STZ（55 mg/kg）誘導1型糖尿病大鼠模型，72 h后檢測大鼠尾靜脈空腹血糖，＞16.7 mmol/L作為糖尿病模型［8］。其中，模型制備成功50只，失敗8只，成模率為86.2%。將成功的糖尿病大鼠模型采用隨機數字表法分成模型組、EECP 50 mg/kg組、EECP 100 mg/kg組、EECP 200 mg/kg組及二甲雙胍組，每組10只。另外10只大鼠作為正常組。動物成模1周后給藥灌胃，每日1次。依據文獻［7］，EECP 50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg組給予相應劑量EECP灌胃治療，二甲雙胍組給予二甲雙胍75 mg/kg灌胃，藥物溶劑為雙蒸水，正常組和模型組給予等劑量雙蒸水，給藥體積為10 mL/g。實驗期間監測大鼠血糖變化。未見大鼠死亡，實驗遵循國家《實驗動物管理條例》。12周后，處死大鼠用于各項指標檢測。

1.2.2 標本采集12周治療結束后，在同一時間點檢測大鼠尾靜脈空腹血糖，大鼠處死前麻醉固定，于心尖搏動最強處進針，利用心臟跳動血液進入注射器，每只大鼠取心臟血1 mL，離心取上清-20℃凍存，待測血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）。12周后，每組隨機取5只大鼠，打開大鼠腹腔，用4%多聚甲醛經心臟固定自身組織，固定完成后取出腎臟進行石蠟包埋、切片。剩余5只大鼠處死后取完整腎臟做冠狀切面，其中1/2依據質量加蛋白裂解液，冰上剪碎，4℃離心25 min后取上清，-20℃保存用于Western blot；另1/2與生理鹽水按1∶4制成勻漿，3 000 r/min離心5 min，上清用于腎組織MDA含量、SOD活性檢測。

1.2.3 血Scr和BUN及 腎 組 織MDA含 量、SOD活 性 的 檢測Scr和BUN采用全自動生化分析儀檢測，MDA含量、SOD活性采用相應試劑盒，具體步驟按照說明書執行。

1.2.4 HE染色經1.2.2制備的大鼠腎臟切片脫蠟后PBS洗3次；蘇木素浸染，2 min，自來水沖洗；伊紅浸染1 min，自來水沖洗；脫水透明后封片，倒置顯微鏡拍照觀察大鼠腎臟病理改變。

1.2.5 免疫組化檢測大鼠腎臟NOX4表達經1.2.2制備的大鼠腎臟石蠟切片脫蠟后于PBS洗3次；3%H2O2室溫12 min，PBS洗3次，每次3 min；3%山羊血清室溫孵育30 min；滴加兔抗大鼠NOX4（1∶800），4℃過夜；PBS洗3次，每次3 min；滴加二抗（1∶500），室溫30 min；PBS洗3次，每次3 min；滴加SABC試劑，室溫30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色，復染、脫水、透明封片后顯微鏡拍照，以胞質中出現棕褐色為陽性染色，每張切片在顯微鏡下取5個高倍視野，各計數200個細胞，計算平均陽性細胞百分比為NOX4表達陽性率。

1.2.6 Western blot檢測大鼠腎臟NOX4、p-p38 MAPK及p38 MAPK相對表達量BCA法測定蛋白含量，電泳時加入15 μL樣品；120 V電壓電泳，轉膜后1%BSA封閉2 h；加入一抗NOX4（1∶10 000）、p-p38 MAPK（1∶5 000）、p38 MAPK（1∶5 000），4℃孵育過夜；TBST洗4次，每次5 min；加入二抗室溫孵育2 h；TBST洗4次，每次5 min；ECL顯影，以β-tublin為對照，image J軟件分析灰度值，蛋白相對表達=蛋白灰度值/內參灰度值×100%。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EECP對大鼠血糖的影響與正常組比較，模型組建模后血糖明顯升高（P＜0.05）；與EECP 50 mg/kg組比較，EECP 100 mg/kg組、EECP 200 mg/kg組、二甲雙胍組血糖明顯降低（P＜0.05）；與EECP 100 mg/kg組和EECP 200 mg/kg組比較，二甲雙胍組血糖明顯降低（P＜0.05）；EECP 100 mg/kg組與EECP 200 mg/kg組、正常組與二甲雙胍組建模后血糖比較差異無統計學意義，見表1。

Tab.1 Comparison of blood glucose before and after modeling in 6 groups of rats表1 6組大鼠建模前后血糖的比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of blood glucose before and after modeling in 6 groups of rats表1 6組大鼠建模前后血糖的比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01，a與正常組比較，b與模型組比較，c與EECP 50 mg/kg組比較，d與EECP 100 mg/kg組比較，e與EECP 200 mg/kg組比較，P＜0.05；表2～4同

組別正常組模型組EECP 50 mg/kg組EECP 100 mg/kg組EECP 200 mg/kg組二甲雙胍組F建模前血糖（mmol/L）6.29±0.20 6.32±0.18 6.23±0.18 6.26±0.25 6.29±0.17 6.24±0.14 0.327建模治療后血糖（mmol/L）6.25±0.14 21.41±1.54a 19.10±1.16ab 15.36±0.57abc 15.55±0.47abc 6.46±0.36bcde 547.166＊＊

2.2 EECP對大鼠Scr與BUN含量的影響與正常組比較，模型組Scr、BUN明顯升高（P＜0.05）；與EECP 50 mg/kg組比較，EECP 100 mg/kg組、EECP 200 mg/kg組、二甲雙胍組Scr、BUN明顯降低（P＜0.05），與EECP 100 mg/kg組和EECP 200 mg/kg組比較，二甲雙胍組Scr、BUN明顯降低；EECP 100 mg/kg組與EECP 200 mg/kg組、正常組與二甲雙胍組Scr、BUN比較差異無統計學意義，見表2。

Tab.2 Comparison of Scr and BUN contents between 6 groups of rats表2 6組大鼠Scr與BUN含量的比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of Scr and BUN contents between 6 groups of rats表2 6組大鼠Scr與BUN含量的比較（n=10，±s）

組別正常組模型組EECP 50 mg/kg EECP 100 mg/kg EECP 200 mg/kg二甲雙胍組F Scr（μmol/L）28.16±0.65 48.29±0.96a 43.26±1.02ab 38.21±1.11abc 38.14±0.67abc 28.20±0.48bcde 903.437＊＊BUN（mmol/L）6.61±0.15 17.38±0.51a 16.57±0.47ab 13.40±0.48abc 13.60±0.28abc 6.67±0.17bcde 1584.983＊＊

2.3 EECP對大鼠腎組織氧化應激的影響與正常組比較，模型組MDA升高、SOD降低（P＜0.05）；與EECP 50 mg/kg組比較，EECP 100 mg/kg組、EECP 200 mg/kg組、二甲雙胍組MDA降低、SOD升高（P＜0.05）；與EECP 100 mg/kg組和EECP 200 mg/kg組比較，二甲雙胍組MDA降低、SOD升高（P＜0.05）；EECP 100 mg/kg組與EECP 200 mg/kg組、正常組與二甲雙胍組MDA、SOD比較差異無統計學意義，見表3。

Tab.3 Comparison of oxidative stress indexes between 6 groups of rats表3 6組大鼠氧化應激指標的比較（n=10，±s）

Tab.3 Comparison of oxidative stress indexes between 6 groups of rats表3 6組大鼠氧化應激指標的比較（n=10，±s）

組別正常組模型組EECP 50 mg/kg組EECP 100 mg/kg組EECP 200 mg/kg組二甲雙胍組F MDA（μmol/L）5.62±0.15 13.80±0.35a 10.78±0.25ab 6.16±0.11abc 6.22±0.15abc 5.68±0.13bcde 1 355.355＊＊SOD（U/L）110.90±1.04 65.70±0.58a 68.14±0.92ab 78.80±0.61abc 78.38±0.73abc 110.22±1.36bcde 2 438.524＊＊

2.4 EECP對大鼠腎臟病理學的影響與正常組比較，模型組腎小球體積增大，細胞外基質增生，并可見腎小管上皮細胞水腫；與模型組相比，EECP 100 mg/kg組、EECP 200 mg/kg組及二甲雙胍組腎小球體積明顯減小，水腫明顯減輕，見圖1。

Fig.1 Effects of EECP on renal tissue structure of rats(HE staining,×400)圖1 EECP對大鼠腎臟組織結構的影響（HE染色，×400）

2.5 EECP對大鼠腎 組 織NOX4、p-p38 MAPK及p38 MAPK蛋白相對表達的影響各組之間p38 MAPK表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組NOX4陽性率、NOX4蛋白相對表達量、p-p38 MAPK蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與EECP 50 mg/kg組比較、EECP 100 mg/kg組、EECP 200 mg/kg組、二甲雙胍組NOX4陽性率、NOX4蛋白相對表達量、p-p38 MAPK蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與EECP 100 mg/kg組和EECP 200 mg/kg組比較，二甲雙胍組NOX4陽性率、NOX4蛋白相對表達量、p-p38 MAPK蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）；EECP 100 mg/kg組與EECP 200 mg/kg組、正常組與二甲雙胍組比較差異無統計學意義，見圖2、3，表4。

Fig.2 Effects of EECP on the expression of NOX4 in rat kidney(immunohistochemistry,×400)圖2 EECP對大鼠腎臟組織NOX4表達的影響（免疫組織化學染色，×400）

Fig.3 Western blot analysis the protein expressions of NOX4 and pp38 MAPK in rat kidney圖3 Western blot檢測大鼠腎組織NOX4及p-p38 MAPK蛋白相對表達

Tab.4 Comparison of the expressions of NOX4 and pp38 MAPK in the kidney tissues between 6 groups of rats表4 6組大鼠腎組織NOX4及p-p38 MAPK表達的比較（n=5，%，±s）

Tab.4 Comparison of the expressions of NOX4 and pp38 MAPK in the kidney tissues between 6 groups of rats表4 6組大鼠腎組織NOX4及p-p38 MAPK表達的比較（n=5，%，±s）

組別正常組模型組EECP 50 mg/kg組100 mg/kg組200 mg/kg組二甲雙胍組F NOX4陽性率9.34±0.11 32.48±0.38a NOX4蛋白10.78±0.08 35.62±0.50a p38 MAPK蛋白38.34±0.67 38.56±0.32 p-p38 MAPK蛋白6.26±0.17 32.58±0.61a 28.40±0.42a 15.44±0.43abc 15.22±0.62abc 9.22±0.08bcde 3 180.667＊＊31.58±0.63a 17.34±0.41abc 17.32±0.56abc 10.58±0.13bcde 2 936.802＊＊38.08±0.71 38.38±0.26 38.30±0.59 38.34±0.61 0.387 28.30±0.45a 15.78±0.51abc 16.16±0.54abc 6.30±0.19bcde 3 053.664＊＊

3 討論

DN是世界范圍內慢性腎損傷的主要病因之一，為血管性疾病的高危因素。DN的功能特點是腎小球濾過功能障礙和腎小球肥大。尿白蛋白排泄增加、Scr水平升高是評估DN患者腎功能的重要指標［9］。STZ誘導的糖尿病大鼠模型已廣泛應用于其相關并發癥的研究［10］。本研究成功地建立了DN大鼠模型，結果顯示，模型組血Scr和BUN水平明顯增加，腎小球體積增大，細胞外基質增生等病理改變，與以往關于DN的文獻［11］報道相符。蜂膠具有多種藥理作用，包括抗菌、免疫調節、抗氧化及抗炎等。EECP為蜂膠的提取物，其含有大量的酚醛和多酚化合物，因此具有較強的抗氧化活性［5］。EECP可直接調節糖尿病大鼠血糖，同時也可降低MDA含量、提高SOD活性進而對抗視網膜氧化應激損傷［7］。在本實驗中，EECP100 mg/kg、200 mg/kg組及二甲雙胍組可明顯降低T1DM大鼠血糖、Scr和BUN水平，同時HE染色顯示大鼠腎組織損傷程度明顯減輕，驗證了EECP對T1DM大鼠的治療作用。然而，EECP100 mg/kg和200 mg/kg治療效果之間差異并不明顯，說明提高藥物的劑量并不能增加其治療效果。

慢性高血糖誘導的氧化應激在DN的進程中有重要作用。氧化應激的程度主要取決于活性氧的生成，特別是O2-和H2O2的生成，以及SOD和MDA在內的抗氧化防御系統之間的平衡［12］。文獻報道，DN患者內源性抗氧化分子（包括SOD和谷胱甘肽過氧化物酶）明顯減少，而MDA含量明顯增加，最終引起活性氧增加，加速腎損傷進程［13］。腎臟容易受到氧化應激影響，活性氧水平的升高可直接造成腎臟損傷。Sameni等［14］研究發現，EECP可明顯降低糖尿病大鼠體質量、血糖水平、腎小球基底膜厚度和腎小球面積，同時還可顯著降低MDA含量，提高SOD，從而提高總抗氧化能力，這與本研究結果相一致。本研究發現，對DN大鼠給予EECP 50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg灌胃治療后，顯示出了明顯的抗氧化作用，MDA含量明顯下降，SOD活性明顯增加，這提示EECP可能通過抗氧化應激對DN大鼠產生保護作用，但具體機制不清。

NOX4為腎細胞產生活性氧的重要分子，通過催化電子從NAPDH轉移到分子氧而產生超氧陰離子［15］。NOX4引起的活性氧升高被認為能夠促進腎臟系膜細胞和腎小管細胞細胞外基質的積累［16］。在STZ誘導的DN中，NOX4定位于腎皮質細胞的膜和線粒體，并大量表達［17］。此外，NOX4近來被認為能夠加速DN動物模型腎損傷的進程，是糖尿病早期腎臟活性氧的主要來源，在足細胞中由于高血糖誘導而上調，下調NOX4對DN小鼠模型具有腎臟保護作用［18］。此外，NOX4抑制劑GKT137831可通過抑制腎小球肥大、減少尿白蛋白排泄和足細胞丟失而緩解DN的腎臟損傷［19］。有文獻報道，MAPK家族中p38 MAPK表達的變化對氧化應激損傷尤為重要［20］。本研究進一步證實，DN狀態下大鼠腎臟pp38 MAPK和NOX4表達明顯上調，而給予EECP治療后，可明顯促進p-p38 MAPK和NOX4表達下調。在p-p38 MAPK和NOX4表達下調的同時，MDA含量明顯下降，SOD活性明顯增加，這提示EECP在一定程度上可以抑制p-p38 MAPK和NOX4的表達，進而通過抗氧化作用保護DN大鼠的腎臟。

綜上所述，EECP可通過降低T1DM大鼠血糖、Scr和BUN水平，增強大鼠抗氧化能力進而緩解T1DM大鼠腎臟損傷，其機制可能與降低血糖和抑制p38 MAPK/NOX4信號通路有關。EECP治療效果雖沒有達到正常組標準，與二甲雙胍治療效果尚有差距，但為新藥開發提供了更多的思路。