LncRNA-ATB在胃癌細胞中的表達及體外功能實驗研究

智亮輝，劉 偉，李 偉，甄四虎，焦喜林

在世界范圍內，胃癌是第二大癌癥相關致死性疾病[1],在我國是繼肺癌、肝癌后的第三大高發惡性腫瘤，預后差、病死率高，嚴重威脅了我國人民的生命健康[2]。胃癌的演化進程涉及多種致癌基因激活、抑癌基因失活和復雜分子調控機制[3]。近年來靶向藥物、生物治療、免疫治療等取得了一定進展，然而胃癌患者的整體5年生存率仍然徘徊在20%左右[4]，且中晚期患者居多，預后差。因此尋找新的胃癌演化進程中有效靶點用于臨床診斷，評估預后，開發相應作用靶點的藥物是目前亟待解決的問題，對于提高胃癌患者的臨床診治水平和長期生存有重大意義。本課題組前期研究發現LncRNA-ATB在胃癌中高表達且提示患者預后不良，但其具體功能及作用機制尚需深入研究。現報告如下。

1 材料和方法

1.1實驗細胞和試劑 人胃癌細胞系BGC-823、MGC-803、SGC-7901、AGS及人正常胃黏膜上皮細胞GES1購自中國科學院上海細胞庫。RNA提取及反轉錄試劑盒分別購自美國Thermo Fisher公司、日本TaKaRa公司，熒光實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒SYBRPremix Ex Taq TMⅡ購自日本TaKaRa公司，LncRNAATB-siRNA和NC由Invitrogen公司設計并合成(敲低組設計si1、si2、si3共3條)，Lipofectamine TM 2000轉染試劑和Transwell小室分別購自購于美國Invitrogen公司及Corning公司，胎牛血清、RPMI-1640培養基、0.25%胰酶、Penicillin-Streptomycin雙抗購于美國Hyclon公司，RIPA高效蛋白裂解液購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養和篩選:胃癌細胞(BGC-823、MGC-803、SGC-7901、AGS)及人正常胃黏膜上皮細胞GES1均采用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養基置于37℃、5%CO2培養箱中培養，每2～3天傳代一次，選取對數生長期細胞進行實驗。待細胞80%融合后，收集細胞，用Trizol 裂解細胞，分別提取細胞總RNA，反轉錄cDNA為模板。lncRNA-ATB引物序列為：上游5-CTTCACCAGCACCCAGAGA-3，下游5-AAGACAGAAAAACAGTTCCGAGTC-3；內參GAPDH引物序列為：上游5-TTGGTATCGTGGAAGGACTC-3A，下游5-TGTCATCATATTTGGCAGGTT-3。qRT-PCR反應條件為：95℃預變性 45 s，75℃ 15 s，60℃ 30 s，35個循環，實驗重復3次。記錄各組反應Ct值，以2-ΔΔCt表示待測基因的表達水平。

1.2.2細胞轉染及鑒定:選取BGC-823和MGC-803胃癌細胞系進行后續功能研究，分為對照(NC)組，si1、si2、si3組。培養細胞3～5 d，于轉染前12 h將細胞懸液種植于六孔板中，待細胞融合度達到30%左右時進行實驗，取4個EP管，分別加入200 μl無牛血清無雙抗培養基，取2管加入3 μl轉染試劑lipo 2000，輕輕搖晃混勻；另2管分別加入LncRNA-ATB-shRNA/NC，搖晃混勻，常溫放置5 min。將LncRNA-ATB-shRNA/NC和lipo 2000混在一起，輕輕搖晃混勻，常溫放置15 min。將六孔板中待轉染的細胞換成無牛血清無雙抗培養基，將上述混合液按分組加入六孔板中，輕輕搖晃混勻，培養8 h后取出，換成含牛血清含雙抗培養基。48 h后收取細胞提取 RNA，鑒定轉染效率。構建瞬時轉染敲低lncRNA-ATB的胃癌細胞系。

1.2.3細胞侵襲和遷移：Transwell 小室實驗檢測胃癌細胞的侵襲和遷移能力。實驗前1天用 Matrigel基質膠覆蓋小室上室的基底膜，在培養箱過夜。實驗時將轉染后細胞懸浮，每個小室上室加入密度為 1×105個/ml細胞懸液200 μl，下室加入500 μl含20%牛血清的培養基，培養48～72 h后，取出小室，用PBS沖洗2遍，并用棉簽輕輕擦去上室底層的殘余細胞及培養基，用10%甲醛固定細胞5 min，結晶紫溶液染色15 min，自來水沖洗，放置于倒置顯微鏡下，隨機選取3個視野,計數染色細胞的平均值進行統計學分析。遷移實驗時，Transwell小室的上室基底膜無需Matrigel 覆蓋基質膠，其他步驟與細胞侵襲實驗相同。

1.2.4細胞克隆：將轉染后細胞接種于六孔板中，每孔接種1000個細胞，設置3個復孔。培養10 d，每2～3天換液一次。第10天取出細胞，用PBS沖洗2遍，加入10%甲醛固定5 min。棄甲醛，加入結晶紫溶液常溫下染色15 min。然后用自來水緩慢沖洗培養板，將結晶紫洗凈，室溫晾干，拍照計數染色細胞，進行統計學分析。

1.2.5細胞增殖：在96孔板中分別接種BGC-823和MGC-803細胞(每孔3000個細胞)，分為實驗組(si2、si3)及對照組(NC)，每組設5個復孔，分別于0、24、48、72、96 h用CCK-8 法檢測BGC-823和MGC-803細胞的增殖情況，避光加入10 μl CCK-8(5 mg/ml)，在培養箱中孵育2 h。使用酶標儀測定細胞OD值，計算每組平均值，重復3次。

2 結果

2.1lncRNA-ATB在正常胃和胃癌細胞系中的表達水平 與正常胃黏膜上皮細胞GES1相比，lncRNA-ATB在胃癌細胞BGC-823、MGC-803、SGC-7901、AGS表達均顯著升高(P<0.05)。見圖1。本實驗選取升高差異最明顯的BGC-823和MGC-803進行后續研究。

圖1 GES1和MGC-803、BGC-823、SGC-7901、AGS細胞lncRNA-ATB表達水平比較

2.2構建穩轉細胞系及鑒定 si2、si3組BGC-823細胞lncRNA-ATB表達水平分別為0.43±0.29、0.32±0.26；si2、si3組lncRNA-ATB表達水平顯著低于NC組(P<0.05)。si2、si3組MGC-803細胞lncRNA-ATB表達水平分別為0.45±0.23、0.25±0.14，si2、si3組lncRNA-ATB表達水平顯著低于NC組(P<0.05)。見圖2。因此后續功能實驗選取si2、si3作為對照組進行。

圖2 MGC-803、BGC-823細胞lncRNA-ATB表達水平比較

2.3敲低lncRNA-ATB后對胃癌細胞遷移、侵襲能力的影響

2.3.1對BCG-823細胞遷移、侵襲能力影響：遷移實驗中NC組、si2組和si3組BCG-823細胞計數分別為200.00±10.44、75.00±9.52、48.00±7.56；與NC組相比，si2組和si3組BCG-823細胞計數顯著降低(P<0.05)。侵襲實驗中NC組、si2組和si3組BCG-823細胞計數分別為175.00±12.31、54.00±8.55、47.00±6.74；與NC組相比，si2組和si3組BCG-823細胞計數顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 敲低lncRNA-ATB后對BGC-823體外遷移侵襲能力的影響

2.3.2對MGC-803細胞遷移、侵襲能力影響：遷移實驗中NC組、si2組和si3組BCG-803細胞計數分別為195.00±9.88、54.00±7.61、47.00±8.32；與NC組比較，si2組和si3組BCG-803細胞計數顯著降低(P<0.05)。侵襲實驗中NC組、si2組和si3組的BCG-803細胞計數分別為173.00±7.36、48.00±7.57、45.00±6.83；與NC組相比，si2轉染組和si3轉染組BCG-803細胞計數顯著降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 敲低lncRNA-ATB后對胃癌細胞MGC-803體外遷移侵襲能力的影響

2.4敲低lncRNA-ATB后胃癌細胞克隆能力變化的比較 NG組、si2組、si3組BGC-823細胞克隆集落生長數目分別為785.00±5.02、213.00±7.82、195.00±4.24。與NC組比較，si2組、si3組BGC-823細胞克隆集落生長數目顯著減少(P<0.01)。NC組、si2組、si3組MGC-803細胞克隆集落生長數目分別為812.00±12.35、205.30±12.32、195.00±15.47。與NC組比較，si2組、si3組MGC-803細胞克隆集落生長數目顯著減少(P<0.01)。見圖5。

圖5 敲低lncRNA-ATB后對BGC-823和MGC-803細胞克隆形成能力影響

2.5敲低lncRNA-ATB后對胃癌細胞增殖能力的影響 與NC組比較，si2組和si3組BGC-823、MGC-80細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。見圖6。

圖6 敲低lncRNA-ATB后對BGC-823和MGC-803細胞增殖能力的影響

3 討論

人類全基因組中，只有2%的基因可以編碼蛋白，其他基因均轉錄為非編碼RNA[5-6]。非編碼RNA根據長度分為：小ncRNA(<200 nt)及 lncRNA(>200 nt)。lncRNA 由于長度及結構原因，其高級結構決定了其重要功能[7]。既往多個研究表明，lncRNA廣泛在多個細胞分子事件中參與腫瘤細胞的惡性生物學行為，在復雜的分子生物調控網絡中發揮重要作用[7]。國內外研究證實，lncRNA在各種癌癥中廣泛表達，具有腫瘤特異性及表達多樣性[8-9]。研究表明，多種lncRNA 在胃癌演化進程的重要節點存在異常表達，與胃癌的異常分化、遷移、侵襲等惡性生物學行為密切相關，并能指導患者預后，在患者術后監測輔助治療效果判斷方面有重要意義[10-11]。如：SNHG5在胃癌發生發展過程中發揮抑癌作用[12]；GClnc1在胃癌的進展中發揮促癌作用[13]；HOTAIR、lncRNA-H19促進胃癌細胞的侵襲轉移[14-15]。研究表明lncRNA-ATB與惡性腫瘤的發生發展密切相關，廣泛參與了惡性腫瘤細胞的多個分子事件[16]，其在結直腸癌和肝癌的發展進程中發揮重要作用[17-18]。但lncRNA-ATB在胃癌中的具體功能尚未見研究報道。

侵襲轉移是惡性腫瘤特有的生物學行為，也是腫瘤復發致死的主要原因，因此探尋腫瘤細胞發生遷移侵襲的相關癌基因有重大意義。本課題組首先采用qPCR在4種胃癌細胞系中驗證了lncRNA-ATB的表達水平，篩選出高表達lncRNA-ATB的兩種胃癌細胞系BGC-823和MGC-803進行后續功能實驗。設計LncRNA-ATB-shRNA/NC干擾序列，構建瞬時轉染敲低lncRNA-ATB的胃癌細胞系。采用qPCR技術進行驗證，選取敲低效果較好的si2和si3進行后續實驗。本實驗結果顯示，敲低lncRNA-ATB后si2組、si3組BGC-823、MGC-803遷移、侵襲能力較NC組明顯降低。提示lncRNA-ATB對胃癌的遷移、侵襲能力有促進作用。本實驗結果同時表明，敲低lncRNA-ATB后si2組、si3組BGC-823、MGC-803細胞克隆能力和增殖能力較NC組顯著降低。上述實驗結果表明lncRNA-ATB在體外發揮癌基因的作用，促進胃癌細胞的增殖、遷移侵襲能力。但具體機制有待進一步研究。

綜上所述，lncRNA-ATB在體外對胃癌細胞的惡性生物學行為發揮重要的調控作用，對胃癌進展有重要的促進作用，但是其具體作用機制仍有待深入研究。