龍膽苦苷上調AMPKα1、Nrf2 對缺氧缺血性腦損傷大鼠心肌損傷和線粒體功能的影響

陳金良， 張青， 吳亮， 黃世文， 田少華

（1. 赤壁市人民醫院醫療聯合體中西醫結合內科，湖北赤壁 437300；2. 武漢科技大學附屬醫院內科，湖北武漢 430000）

缺氧缺血性腦病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是由于各種圍生期因素引起的新生兒缺氧缺血 性 腦 損 傷（hypoxic- ischemic brain damage，HIBD），可引起不可逆的腦組織損傷，且多伴有嚴重的遠期后遺癥如腦癱、癲癇等[1]。研究[2]顯示，在HIBD的同時常伴隨心臟等重要臟器缺血再灌注損傷，心腦血管疾病常相伴發生，臨床治療需在減輕腦組織損傷的同時保護心肌組織損傷。目前，HIBD 發生的病理機制尚不明確，可能與線粒體功能障礙、過多的氧自由基、細胞凋亡等有關，臨床主要采用對癥治療、支持治療及腦神經營養等治療，尚無特效的治療藥物[3-4]。那么，尋找有效的治療藥物，改善HIBD的心腦組織損傷具有重要的意義。HIBD 急性期可歸屬于中醫文獻記載的 “胎驚”“胎癇”“胎搐”，以鎮肝熄風，清心安神為主。龍膽為龍膽科植物龍膽Gentiana scabra Bge. 及三花龍膽Gentiana triflora Pall. 的根及根莖。味苦，性寒，入肝、膽經，瀉肝膽實火，除下焦濕熱，可治頭痛，目赤，脅痛，小兒驚癇等。龍膽苦苷（gentiopicroside）是從龍膽中提取的有效活性成分，具有利膽、抗炎、健胃、降壓等作用[5]。已有研究[6]顯示，龍膽苦苷可以保護小鼠缺血缺氧再灌注心肌組織損傷。因此，本研究建立了大鼠HIBD 模型，旨在分析龍膽苦苷治療HIBD 心肌損傷的作用機制，為臨床治療提供一定的理論依據，也為新藥的研發提供理論基礎，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1動物SPF級7日齡新生SD大鼠60只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物質量合格證號：SCXK（京）2015-0001，飼養于本院動物中心實驗室，保持室溫恒定為25 ℃，模擬晝夜，自由攝食與飲水。

1. 2藥物、試劑與儀器龍膽苦苷（美國Sigma-Aldrich公司，批號：G21690），純度≥98%，化學式為C16H20O9，分子量為356.32。戊巴比妥鈉（美國Sigma-Aldrich 公司）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）和肌紅蛋白（Mb）檢測試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ活性檢測試劑盒（北京綠源伯德生物科技有限公司）；兔抗人c-Myc、腺苷酸活化蛋白激酶α1（AMPKα1）和Nrf2、Bcl-2、Bax 和cleaved Caspase-3單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG（上海信裕生物科技有限公司）。XBS-02-3D 小鼠缺氧（高低氧）裝置（杭州艾普儀器設備有限公司）；Sequoia512型心臟彩色多普勒超聲（德國西門子公司）；UV-240紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）。

1. 3造模、分組與干預將60 只新生SD 大鼠隨機選取50 只采用結扎頸總動脈結合低氧環境建立HIBD模型[7]。操作方法：給予大鼠腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉溶液2 mL/kg進行麻醉，分離并結扎左頸總動脈，恢復2 h 后再置于體積分數8%氧氣的低氧環境中2 h，之后放回母鼠身邊繼續喂養7 d。其余10 只大鼠設為假手術組，僅分離左頸總動脈，不進行結扎。50只造模大鼠死亡6只，隨機選取4 只造模大鼠斷頭取腦組織，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，若HE 染色出現明顯病變，則表明造模成功。將40 只造模成功的大鼠隨機分為模型組和龍膽苦苷低、中、高劑量組，每組各10 只。造模后6 h，給予龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠灌胃龍膽苦苷（劑量[8]分別為30、60、120 mg·kg-1·d-1），模型組和假手術組灌胃等體積生理鹽水，連續灌胃7 d。

1. 4觀察指標與方法

1. 4. 1 大鼠心功能及心肌損傷檢測 治療后，采用心臟彩色多普勒超聲檢查心率（HR）、左心室射血分數（LVEF）、左心室短軸縮短率（FS）以及左心室壁厚度（LVWT）的檢測。檢測心功能后，迅速斷頭取血，離心（3 500 r/min，10 min），分離血清，置于-20 ℃冰箱暫存，取大鼠左心室組織置于-80 ℃冰箱暫存。采用ELISA 法檢測心肌損傷標記物CK-MB、cTnI 和Mb 水平，氧化應激指標SOD、MDA和LDH水平。

1. 4. 2 HE 染色法觀察大鼠腦組織病理表現 無菌取大鼠腦海馬組織，用40 g/L多聚甲醛固定，進行常規脫水、透明、浸蠟和包埋，切片（4 μm），HE染色，光鏡下觀察大鼠的海馬組織損傷情況。

1. 4. 3 HE 染色法觀察心肌病理損傷情況 取各組大鼠左心室冠狀面中部的環狀心肌組織，用40 g/L多聚甲醛固定，進行常規的脫水、透明、浸蠟和包埋，切片（4 μm）。進行HE染色，光鏡下觀察大鼠的心肌組織損傷情況。

1. 4. 4 采用分光光度法檢測心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ活性 取各組大鼠左心室組織，提取心肌組織細胞線粒體，采用比色法測定線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ活性。

1. 4. 5 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測心肌組織Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3、c-Myc、AMPKα1和Nrf2 的表達 取各組大鼠左心室組織，勻漿，用細胞裂解液嚴格按照蛋白裂解步驟提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量。取50 μg總蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫封閉2 h。加入洗膜緩沖液洗膜，加Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3、c-Myc、AMPKα1 和Nrf2 等一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。洗膜緩沖液洗膜，加HRP 標記的二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育2 h。電化學發光（ECL）法顯示圖像，選用β-actin 作為內參，凝膠成像分析系統分析條帶強弱。

1. 5統計方法采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數± 標準差（x ± s）表示，對計量資料首先進行正態性檢驗，各組均滿足正態性且2組間方差齊，采用單因素方差分析比較多組間差異性，若組間比較有差異，采用SNK-q進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1各組大鼠腦組織病理表現比較圖1 結果顯示：假手術組大鼠海馬組織排列整齊，細胞結構完整，未見明顯異常。模型組可見明顯的細胞腫脹，大量細胞出現核固縮呈三角形。龍膽苦苷中、高劑量組大鼠海馬組織病理變化較模型組明顯減輕，細胞形態趨于正常，僅見少量核固縮細胞；龍膽苦苷低劑量組大鼠海馬組織與模型組比較，無明顯改善。

圖1 各組大鼠腦組織病理表現比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of the pathological features of rat brain tissues in various groups（by HE staining，×400）

2. 2各組大鼠心功能比較表1 結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠HR、LVEF、FS和LVWT均明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠HR、LVEF、FS 和LVWT均明顯下降，且隨著劑量升高，其作用逐漸增強，其中龍膽苦苷中、高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。

2. 3各組大鼠心肌損傷程度比較圖2 結果顯示：假手術組大鼠心肌組織排列整齊，細胞結構完整，未見明顯異常。模型組大鼠心肌組織細胞間隙變寬、排列松散，肌纖維橫截面積明顯縮小。龍膽苦苷中、高劑量組大鼠心肌組織細胞排列較整齊，肌纖維橫截面積明顯大于模型組；龍膽苦苷低劑量組大鼠心肌組織與模型組比較，無明顯改善。

表2結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠CK-MB、cTnI 和Mb 均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠CK-MB、cTnI和Mb均明顯下降，且隨著劑量升高，其作用逐漸增強，其中龍膽苦苷中、高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心功能比較Table 1 Comparison of rat cardiac functions in various groups （x ± s）

圖2 各組大鼠心肌組織病理表現比較（HE染色，×200）Figure 2 Comparison of pathological manifestations of rat myocardial tissues in various groups（by HE staining，×200）

表2 各組大鼠心肌損傷標記物水平比較Table 2 Comparison of rat myocardial injury markers in various groups （x ± s）

2. 4各組大鼠氧化應激水平比較表3 結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠SOD 活性明顯下降（P＜0.05），MDA 和LDH 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠SOD 活性均明顯升高，MDA 和LDH 水平明顯下降，且隨著劑量升高，其作用逐漸增強，其中龍膽苦苷中、高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠氧化應激水平比較Table 3 Comparison of rat oxidative stress levels in various groups （x ± s）

2. 5各組大鼠線粒體功能比較表4 結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠線粒體復合物Ⅰ和線粒體復合物Ⅱ活性明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠線粒體復合物Ⅰ和線粒體復合物Ⅱ活性均明顯升高，且隨著劑量升高，其作用逐漸增強，其中龍膽苦苷中、高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。

2. 6各組大鼠線粒體損傷標記分子水平比較圖3結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠Bcl-2/Bax比值顯著下調（P＜0.05），cleaved Caspase-3和c-Myc的表達量顯著上調（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠Bcl-2/Bax 比值明顯上調，cleaved Caspase-3和c-Myc 的表達量明顯下調，且隨著劑量升高，其作用逐漸增強，其中龍膽苦苷中、高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠線粒體損傷標記分子水平比較（x ± s）Figure 3 Comparison of the levels of rat mitochondrial injury marker molecules in various groups（x ± s）

2. 7各組大鼠心肌細胞氧化應激標記蛋白AMPKα1、Nrf2表達量比較圖4 結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠AMPKα1 和Nrf2 的表達量明顯下調（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷低、中、高劑量組大鼠AMPKα1 和Nrf2 的表達量明顯上調，且隨著劑量升高，其作用逐漸增強，其中龍膽苦苷中、高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠心肌細胞氧化應激標記蛋白AMPKα1、Nrf2表達量比較（x ± s）Figure 4 Comparison of the expression contents of rat mitochondrial oxidative stress marker proteins AMPKα1，Nrf2 in various groups（x ± s）

3 討論

缺氧缺血性腦損傷（HIBD）是圍生期新生兒常見的一種疾病，可以引起多組織臟器功能障礙。CK-MB、cTnI和Mb是臨床常用的反映心肌組織損傷的標志物，HR、LVEF、FS和LVWT是反映心功能的指標[9]。本研究結果顯示，HIBD 模型大鼠的腦組織和心肌組織出現明顯病變，CK-MB、cTnI和Mb 水平明顯升高，HR、LVEF、FS 和LVWT 水平均明顯下降，提示HIBD模型大鼠出現明顯腦組織損傷，心肌組織損傷和功能障礙。已有研究[10]顯示，HIBD 發生的同時常伴隨著心臟組織的缺血再灌注損傷，與本研究結果基本一致，提示HIBD可以引起心肌組織損傷。但現有研究多集中在HIBD所引起的腦組織損傷，對于HIBD引起的心肌組織損傷及治療研究報道較少，因此，本研究建立了新生大鼠的HIBD 模型來探討龍膽苦苷對HIBD 大鼠心肌組織損傷的影響。結果顯示，HIBD 模型大鼠經龍膽苦苷治療后，腦組織和心肌組織病變明顯減輕， CK- MB、 cTnI 和Mb 水平明顯降低，HR、LVEF、FS和LVWT水平均明顯升高，且隨著龍膽苦苷劑量的增加，其作用逐漸增強，提示龍膽苦苷可以呈濃度依賴性地緩解腦組織和心肌組織損傷，改善心功能。

臨床研究[11]顯示，HIBD 發生的機制與機體氧化應激增強、細胞凋亡、線粒體功能障礙等均有關。本研究結果顯示，龍膽苦苷治療可以降低HIBD 模型大鼠的MDA 和LDH 水平，升高SOD 活性，提示龍膽苦苷治療可能通過降低HIBD模型大鼠的氧化應激水平，清除機體過多的氧自由基，修復HIBD模型大鼠心肌組織損傷。線粒體是真核細胞內參與機體能量代謝的重要細胞器，也是細胞內氧自由基產生的主要來源，在細胞內氧化應激、細胞凋亡等多種生理病理過程中均發揮著重要的作用[12]。本研究結果顯示，龍膽苦苷治療后，HIBD 模型大鼠心肌線粒體復合物Ⅰ和線粒體復合物Ⅱ的活性明顯升高。線粒體復合物Ⅰ和線粒體復合物Ⅱ參與組成線粒體上的呼吸鏈復合物，參與調節氧自由基的生成[13]。多項研究[14-15]顯示，缺血缺氧條件下，機體產生的過多的氧自由基可以破壞線粒體結構，引起線粒體結構和功能障礙，誘導心肌組織細胞凋亡，加重心肌組織損傷。故提示龍膽苦苷可能通過降低HIBD模型大鼠的氧化應激水平，保護線粒體結構和功能。c-Myc是機體的一種參與調控多種細胞生物學功能的轉錄因子，參與細胞增殖、代謝和凋亡[16]。研究[17]顯示，c-Myc 可能通過激活Bax，引起線粒體膜結構的改變，誘導細胞色素C 的釋放，激活凋亡執行分子Caspase，降解細胞內的重要蛋白，從而誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，經龍膽苦苷治療后，HIBD 模型大鼠心肌組織Bcl-2/Bax 的比值明顯上調，cleaved Caspase-3 和c-Myc 的表達量明顯下調，提示龍膽苦苷可能通過調節線粒體損傷相關蛋白的表達，保護HIBD大鼠心肌線粒體膜結構和功能，抑制氧自由基的生成。

AMPK 是AMP 依賴的蛋白激酶，也是骨骼肌細胞的能量感受器，與線粒體的功能密切相關，是機體能量代謝調節的關鍵因子。Nrf2是堿性亮氨酸拉鏈家族中活力最強的轉錄因子，具有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結構，是機體內調節氧化應激反應作用最強的轉錄因子[18]。臨床研究[19-20]顯示，AMPK/Nrf2信號通路在降低氧化應激反應，減少內皮損傷、抑制線粒體介導的細胞凋亡中發揮了重要作用。Li等[21]的研究顯示，龍膽苦苷可以激活LKB1/AMPK 信號通路，發揮其保肝作用。本研究結果顯示，龍膽苦苷可以上調HIBD模型大鼠心肌AMPKα1 和Nrf2 的表達，提示龍膽苦苷可能通過激活AMPK/Nrf2 信號通路，發揮其抗氧化作用，修復HIBD模型大鼠心肌組織損傷和保護線粒體功能。

綜上所述， 龍膽苦苷可能通過激活心肌AMPK/Nrf2信號通路，發揮其抗氧化的作用，并具有修復HIBD大鼠的心肌組織損傷和保護心肌線粒體的功能，為臨床治療提供了一定的理論依據。但本研究尚處于基礎研究階段，尚需臨床試驗來驗證。