補中益氣湯加味對慢性阻塞性肺疾病大鼠的治療作用及機制研究

駱志均， 何明豐

（1. 廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405；2. 廣州中醫藥大學附屬佛山市中醫院，廣東佛山 528000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）簡稱慢阻肺，是一種以氣流受限為主要特征的慢性肺部炎癥性疾病，氣流受限不可逆、呈進行性進展[1]。慢阻肺可以導致患者的呼吸功能下降、呼吸衰竭、慢性肺源性心臟病等嚴重并發癥，嚴重影響患者的生存質量和生命健康，已成為全球性的公共衛生問題[2-3]。據流行病學調查顯示，我國目前慢阻肺患者9 990 萬[4]。而且隨著空氣污染加重、吸煙人數增多及老齡人口劇增，我國慢阻肺發病率呈現上升趨勢。研究顯示，免疫功能低下、氣道炎癥和氣道重塑是慢阻肺發生和進展的重要因素[5]。慢阻肺屬于中醫學“咳嗽”“喘證”“肺脹” 等范疇，穩定期核心病機為肺脾氣虛。本課題組臨床上應用補中益氣湯加味治療慢阻肺療效顯著，但是關于其作用機制尚不明確。因此，本研究復制了大鼠慢阻肺模型，采用補中益氣湯加味干預，探討其對慢阻肺大鼠肺功能、免疫功能、炎性因子和氣道重塑因子的影響，從而為補中益氣湯加味臨床防治慢阻肺提供依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1動物健康SD雄性大鼠60只，SPF級，體質量180 ～220 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。動物飼養于佛山市中醫院實驗動物中心，許可證號：SYXK（粵）2018-0125。飼養環境：室溫18 ～22 ℃，濕度50% ～70%，光照12 h/d。

1. 2藥物補中益氣湯加味組成：黃芪15 g，黨參15 g，白術10 g，炙甘草6 g，當歸10 g，陳皮6 g，升麻6 g，柴胡12 g，茯苓10 g，法半夏10 g，桔梗10 g，麥冬10 g。上述中藥飲片購自佛山市中醫院中藥房。煎煮、濃縮中藥液，相當于原藥1.20 g/mL，置于冰箱4 ℃保存備用。地塞米松片，廣東華南藥業集團有限公司生產，批號：20192145。

1. 3試劑與儀器轉化生長因子β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素8（IL-8）酶聯免疫吸附反應（ELISA）試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司）；金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶12（MMP-12）ELISA 試劑盒（上海恒渡生物科技有限公司）； 免疫球蛋白A（IgA）、 免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）ELISA 試劑盒（上海延幕實業有限公司）；脂多糖（北京凱瑞基生物科技有限公司，批號：L16970）。AniRes 2005 動物肺功能分析儀（北京貝蘭博科技有限公司）；FRONTIER?5000 小型多功能臺式離心機[奧豪斯國際貿易（上海）有限公司]；HBS-1096C酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）。

1. 4動物分組、造模和干預所有大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組、模型組、西藥組和中藥組，每組各15只。參照煙熏結合氣管內滴注脂多糖方法[6]制備大鼠慢阻肺模型：將模型組、西藥組和中藥組大鼠置于有機玻璃染毒箱（120 cm × 100 cm× 50 cm）內，香煙點燃后置于調料盒放入2 000 mL集氣瓶中，將煙霧壓入染毒箱內使大鼠被動吸煙染毒。每天10 只香煙，分上下午各煙熏1 次，每次60 min，連續煙熏共80 d。實驗第1天和第31天給予大鼠異氟烷吸入麻醉后氣道內滴注200 μL 的脂多糖。滴注脂多糖當天不吸煙。同期，正常組大鼠呼吸新鮮空氣，實驗第1 天和第31 天給予大鼠異氟烷吸入麻醉后氣道內滴注200 μL 的生理鹽水。最后常規喂養20 d以達到穩定期。若第0.3秒最大呼氣量（FEV0.3）/用力肺活量（FVC）小于70%，即可判斷慢阻肺大鼠模型建立成功[2]。然后按照實驗動物與人體表面積等效量換算比例[7]計算大鼠的給藥劑量，中藥組給予補中益氣湯加味煎液12.6 g·kg-1·d-1灌胃，西藥組給予地塞米松生理鹽水混懸液0.9 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，連續灌胃4 周。4周后檢測指標。

1. 5肺功能檢測測試前1 d禁食不禁飲，以30 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥位固定。用肺功能檢測儀檢測大鼠第0.3秒用力呼氣量（FEV0.3）、用力肺活量（FVC）、FEV0.3 占FVC 預計值百分比（FEV0.3/FVC）、每分鐘最大通氣量（MVV）。

1. 6實驗室指標檢測測試前1 d 禁食不禁飲，麻醉后經腹主動脈取血，以3 000 r/min離心20 min后取上清液，-70 ℃保存。采用ELISA法檢測大鼠血清IgA、IgM、IgG、TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量。剪取右下肺組織400 mg，加生理鹽水1 mL 研磨均漿后離心，取上清液，-70 ℃保存。采用ELISA法檢測大鼠肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TIMP-1、MMP-9、MMP-12含量。具體操作方法按試劑盒說明進行，應用酶標儀于波長620 nm處檢測。

1. 7統計方法采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數± 標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1一般形態觀察正常組大鼠活潑好動，毛發光澤，飲食飲水正常，體質量逐漸增加。造模過程中模型組死亡2 只，西藥組和中藥組各死亡1 只。模型組大鼠毛發枯萎，行動遲緩，喘促，體質量逐漸下降。西藥組和中藥組大鼠一般情況改善明顯，可見行動和飲食飲水增加，無明顯喘促，體質量逐漸恢復正常。

2. 2各組大鼠肺功能的比較表1 結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、MVV 水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠FVC、 FEV0.3、 FEV0.3/FVC、 MVV 水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），除MVV 外，2 個治療組FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC 比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2. 3各組大鼠血清IgA、IgM、IgG水平的比較表2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清IgA、IgM、IgG 水平均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠血清IgA、IgM、IgG水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），且2 個治療組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肺功能的比較Table 1 Comparison of pulmonary functions in various groups （x ± s）

表2 各組大鼠血清IgA、IgM、IgG水平的比較Table 2 Comparison of serum IgA，IgM，IgG levels in various groups （x ± s）

2. 4各組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平的比較表3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），除TGF-β1 外，2 個治療組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平比較，差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

表3 各組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平的比較Table 3 Comparison of the serum levels of TGF-β1，TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8 in various groups （x ± s）

2. 5各組大鼠肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平的比較表4結果顯示：與正常組比較，模型組肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），除TGF-β1 外，2 個治療組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平比較，差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

2. 6各組大鼠肺組織TIMP-1、MMP-9、MMP-12水平的比較表5結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肺組織MMP-9、MMP-12 水平顯著升高，TIMP-1 水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠肺組織MMP-9、MMP-12水平顯著降低， TIMP-1水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），且2 個治療組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平的比較Table 4 Comparison of the levels of TGF-β1，TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8 in lung tissue of various groups （x ± s）

表5 各組大鼠肺組織TIMP-1、MMP-9、MMP-12水平的比較Table 5 Comparison of the levels of TIMP-1，MMP-9，MMP-12 in lung tissue of various groups[x ± s，ρ/（pg·mL-1）]

3 討論

慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）屬于中醫學“咳嗽”“肺脹”“喘證” 等范疇，主要表現為咳嗽、咳痰、喘促等癥狀。中醫學認為本病為本虛標實之病，以脾肺兩虛為本，以痰濁、郁熱為標。肺臟病首先病在肺臟，肺主氣司呼吸，肺氣虛則不能主氣，宣發肅降不利，升降失常則為咳嗽、喘促，肺病及脾，子病及母，脾氣虧虛，不能運化水濕，聚為痰飲，留滯肺竅，則為咳痰[8]。急則治其標，緩則治其本。慢阻肺穩定期以肺脾氣虛為核心病機，以健脾補肺，化痰止咳為治療法則[9]。補中益氣湯為經典方劑，具有補中益氣功效，本研究所用的方藥是在補中益氣湯基礎上加味而成。方中：黃芪甘溫，補中益氣，補肺實衛，益氣固表；黨參、白術、炙甘草甘溫益氣，補益脾胃，助黃芪健脾補肺；陳皮健脾燥濕，調理氣機；升麻、柴胡升陽，助清氣上升以補肺；當歸補血和營，且久病必瘀，當歸兼活血化瘀，一藥兩用。加茯苓健脾滲濕，合黃芪益氣健脾；加半夏燥濕化痰；加桔梗止咳化痰，升提肺氣；加麥冬養陰生津以補肺。諸藥合用，全方共奏健脾補肺、止咳化痰之功。

FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、MVV 是肺功能的重要指標。研究[10]表明，慢阻肺患者肺功能顯著低于正常健康人群。本研究采用煙熏和氣管內滴注脂多糖法建立大鼠慢阻肺模型，結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肺功能FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、MVV，血清IgA、IgM、IgG，肺組織TIMP-1 水平顯著降低，血清和肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及肺組織MMP-9、MMP-12 含量顯著升高（P ＜0.05）。提示慢阻肺大鼠模型造模成功，且慢阻肺大鼠存在免疫功能低下、炎癥反應和氣道重塑等病理表現。

經補中益氣湯加味治療后，慢阻肺大鼠肺功能得到明顯改善。在慢阻肺的發生發展過程中，體液免疫和細胞免疫發揮重要的作用。 IgA、IgM、IgG 是體液免疫的重要組成部分[11]，IgA 是氣道局部黏膜免疫的重要因子，IgM是一種早期抵抗病原微生物的抗體，IgG是最主要的免疫蛋白，可以促進單核細胞的吞噬作用。研究表明，慢阻肺患者血清中IgA、IgM、IgG水平顯著低于正常健康人群[12]，提示慢阻肺存在免疫功能低下。本研究結果顯示，補中益氣湯可以提高慢阻肺大鼠血清IgA、IgM、IgG水平，提示補中益氣湯可以通過提高免疫功能改善慢阻肺大鼠肺功能。

氣道炎癥和氣道重塑是慢阻肺的重要特征和關鍵病理環節，氣道炎癥是氣道重塑的主要病理基礎。研究發現，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎性因子參與了慢阻肺的發生發展。當受到煙霧和脂多糖刺激時，單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞聚集于氣道，刺激TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎性因子釋放，引起氣道慢性炎癥。TNF-α刺激氣道黏液分泌，加重肺水腫，損傷支氣管和肺組織，促進支氣管平滑肌增生，導致氣道重塑，并且促進IL-1β、IL-6、IL-8合成，導致炎癥瀑布級聯反應[13]。IL-1β、IL-6 參與支氣管內自分泌環路，損傷支氣管和肺組織，引起肺功能下降[14]。IL-8可以趨化炎癥細胞和炎性因子聚集在氣道，加重局部炎癥反應[15]。煙霧和脂多糖同時刺激TGF-β1大量表達，導致呼吸道上皮損傷，基底膜增厚，細胞外基質成分改變、血管新生，導致氣道重塑[16]。MMP-9、MMP-12可促進慢阻肺大鼠肺組織細胞外基質的降解[17-18]。 TIMP- 1 是MMP- 9、MMP- 12 的特異性抑制因子， 通過與MMP- 9、MMP-12發生不可逆性結合，阻滯蛋白酶的分解作用而保護肺組織的完整性[18]。當MMP-9、MMP-12降解過度或TIMP-1抑制降解不足，肺組織蛋白降解，肺組織遭到破壞，氣道重塑，導致慢阻肺發生發展。本研究結果顯示，補中益氣湯加味可以降低慢阻肺大鼠血清和肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及肺組織MMP-9、MMP-12 水平，升高肺組織、TIMP-1 水平。提示補中益氣湯可以通過抑制炎癥反應和抑制氣道重塑改善慢阻肺大鼠的肺功能。

綜上所述，補中益氣湯加味可以抑制慢阻肺大鼠的炎癥反應和氣道重塑，提高免疫功能，改善肺功能，從而發揮防治慢阻肺的作用。