基于功能性納米粒子的分子印跡仿生傳感器在食品安全檢測中的應用

顧夢茹，李研東，楊立新，艾連峰，胡高爽，趙丹丹，郝建雄，韓雪，*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050000；2.河北省獸藥監察所，河北石家莊050000；3.河北省疾病預防控制中心，河北石家莊050000；4.河北出入境檢驗檢疫局，河北石家莊050000）

針對食品中有害污染物，發展簡便快捷、靈敏可靠且高通量的現場快速檢測新技術是進一步加強食品安全工作的重要保障。目前常用的檢測方法有氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[1]、液相色譜-質譜聯用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[2]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[3]、電化學檢測技術、免疫分析技術[4]等，然而這些檢測方法存在一定的局限性。如儀器分析法，樣品預處理步驟繁瑣，需要萃取、分離、凈化、衍生化等，檢測時間長，且需要專業人員的操作和維護；免疫分析法價格昂貴、試驗結果易出現假陽性。因此，發展簡便快捷、靈敏可靠且低成本的高通量檢測新技術成為食品安全檢測領域的一個重要研究方向。

生物傳感器是一種能夠對特定生物組織和特殊化學物質進行監控的綜合分析體系，是伴隨生命科學發展進程中起到重要輔助作用的一種監測設備。與傳統的儀器分析法相比，生物傳感器在具有高靈敏度和高選擇性的同時，還具有分析速度快，檢測成本低以及便攜性好等優點。然而，生物傳感器也存在著一些不足。迄今為止，大多數報道的生物傳感器都是基于各種生物大分子材料（主要是酶和抗體）作為傳感器的識別元件構建而成。一方面，具有特征催化能力的酶和高特異性的抗體通常都較難獲得，提取和純化過程復雜耗時，且成本高昂；另一方面，這些生物大分子材料對反應條件的要求十分苛刻，很容易受到外界環境的影響，并且保存困難。分子印跡技術（molecular imprinting technique，MIT）是近些年迅速崛起的一門融合了高分子化學、生物化學以及材料學等研究領域成果的交叉學科技術。該技術通過合成出對特定的目標分子具有特異性識別能力的分子印跡聚合物（molecular imprinting polymer，MIP）來實現對樣品的前處理。分子印跡聚合物MIP是以目標分子（印跡分子）作為模板，將具有結構上互補的功能化聚合物單體通過共價或非共價鍵與模板分子結合，并加入交聯劑進行聚合反應，反應完成后將模板分子洗脫出來，形成一種具有與目標分子大小、形狀、作用位點互補的空穴[5]。因此，將該技術與傳感技術相結合，可以克服生物大分子材料存在的種種不足，具有特異性好，機械強度好，不易受基質干擾等優點。

近年來，納米科學技術的發展引起了越來越多科研工作者的關注，是20世紀90年代發展壯大起來的一門多學科交叉融合技術。由于量子限域效應及較大的比表面積，使納米材料具有一些特殊的物理、機械及化學性質，如磁性材料的超順磁性能、量子點量子效應和尺寸效應，在食品安全檢測領域有著巨大的應用潛能。利用納米材料新穎特殊的性質可以改善現有分子印跡仿生傳感檢測的不足，為食品安全監控提供直接、有效、低成本的檢測技術。本文對基于功能性納米粒子的分子印跡仿生傳感檢測在食品安全檢測領域的應用進行綜述，包括基于量子點、上轉換納米粒子等熒光材料、磁性納米顆粒、石墨烯材料等，以期為新型分子印跡傳感檢測技術在食品安全檢測領域的發展和應用提供參考。

1 分子印跡聚合物制備方法

1.1 懸浮聚合法

懸浮聚合法是目前制備分子印跡聚合物的常用方法之一，此方法是將模板分子、功能單體及交聯劑等置于水或極性較高的溶劑中，再通過攪拌分散成小液滴懸浮于溶劑中進行聚合反應[6]。但是此種方法無法應用在模板分子和功能單體溶于水和極性溶劑的聚合物的制備。

1.2 沉淀聚合法

沉淀聚合是將模板分子、功能單體、交聯劑及引發劑溶于制孔劑中，形成均一且高度交聯的聚合物，反應形成的聚合物不溶于溶劑，并以沉淀的形式形成聚合物[7]。該方法因制備體系中不需要加入表面活性劑且制備出的聚合物微球形狀大小統一等優點，被較多的應用在分子印跡聚合物的制備中。

1.3 本體聚合法

本體聚合法是最常用的一種傳統制備方法。按照一定比例混合模板分子、功能單體、制孔劑、交聯劑、引發劑，在真空密閉環境中，反應沉淀形成聚合物，但是該方法獲得的聚合物成塊狀，需要通過粉碎、研磨、過篩、層降才能得到一定粒徑的分子印跡聚合物[8]。

1.4 乳液聚合法

乳液聚合法是將模板分子、功能單體、交聯劑和表面活性劑溶于水或有機溶劑，通過高速攪拌加快乳化速度，最后在引發劑的作用下聚合生成聚合物，然而此種方法存在容易受到乳化劑的影響，且聚合過程中乳液的穩定性不易控制等問題[9]。

1.5 溶膠-凝膠法

溶膠-凝膠法是將模板分子、功能單體、交聯劑、引發劑分散在制孔劑中，然后經過水解反應生成活性單體，活性單體進行聚合，開始成為溶膠，進而生成具有一定空間結構的凝膠，經過干燥和熱處理制備出納米粒子和所需要材料[10]。

1.6 表面分子印跡法

表面分子印跡技術通常是以納米材料為載體，模板分子在其表面進行聚合反應使得大部分印跡位點存在于表面，有利于模板分子吸附-洗脫的同時還能夠提高材料的靈敏度，表面分子印跡聚合物另一個優點是能夠增加有效吸附面積，并且可以通過選用具有較大比表面積的納米材料作為載體進一步優化表面分子印跡聚合物的這一優點[11-13]。

2 基于功能性納米粒子的分子印跡仿生傳感器在食品安全檢測中的應用

2.1 石墨烯分子印跡聚合物

石墨烯是一種由碳原子組成的單層片狀結構，在力學、熱學、電學、光學等方面都擁有著優異的性能，具有硬度強、比表面積大和電子導電率優異等優點，特殊的理化性質使其成為制備表面分子印跡聚合物的理想載體[14]。石墨烯良好的機械性能和熱學性能能夠提高分子印跡聚合物的使用壽命；大的比表面積能夠避免在其表面進行聚合的聚合物包埋過深，有利于模板分子的吸附-洗脫過程；較高的導電率賦予了以石墨烯為載體的分子印跡聚合物能夠應用于電化學傳感器的條件，同時提高了檢測的靈敏度和檢測下限。氧化石墨烯、石墨烯納米片等石墨烯衍生物因對石墨烯材料的進一步優化，也是目前分子印跡材料的研究熱點[15-17]。

M.Zhang等[18]以石墨烯材料為載體制備吡蟲啉分子印跡聚合物應用于電化學傳感器，用該聚合物對玻碳電極進行修飾，得到的傳感器在穩定性和特定識別能力上都得到了高度改進，修飾后的電極上吡蟲啉濃度在0.5 μmol/L～15 μmol/L的范圍內與峰值電流呈線性，檢測限為 0.10 μmol/L 。Ali A.Ensaf等[19]以石墨烯量子點為載體制備甲硝唑分子印跡聚合物，并且用該聚合物和石墨烯納米片共同修飾玻碳電極表面，該傳感器在甲硝唑濃度為 0.005 μmol/L～0.750 μmol/L和0.75 μmol/L～10.0 μmol/L時與峰值電流呈線性關系，檢出限為0.52 nmol/L，該傳感器的高靈敏度和優異的選擇性分別歸因于石墨烯納米片的良好導電性和分子印跡聚合物中甲硝唑的特定位點。制備石墨烯分子印跡聚合物對玻碳電極進行修飾的流程及對模板分子選擇性電化學檢測的原理見圖1。

圖1 制備石墨烯分子印跡聚合物對玻碳電極進行修飾的流程及對模板分子選擇性電化學檢測的原理Fig.1 Schematic procedure for the preparation of GN/MIPs/GCE and our concept for selective electrochemical detection of template molecule

2.2 碳納米管分子印跡聚合物

碳納米管也是碳納米材料的一種，它作為一維碳納米材料，早在1991年就被發現[20]。碳納米管分為單壁碳納米管和多壁碳納米管，單壁碳納米管僅由一層石墨片組成，多壁碳納米管由兩層或兩層以上的石墨片組成。多壁碳納米管相較單壁碳納米管更容易被氧化和切斷，氧化過程會產生羧基和羥基等官能團，并且多壁碳納米管能夠提供更大的有效吸附面積[21]。碳納米管因具有獨特的力學性能、生產工藝成熟且生產成本低等優點被廣泛應用。

Maliwan等[22]通過在碳納米管表面包覆SiO2改善了碳納米管的溶解性和電催化性能，以改良后的碳納米管為載體制備丙溴磷分子印跡聚合物，再用制備的聚合物對玻碳電極進行修飾得到新型的丙溴磷電化學傳感器，修飾后的傳感器導電率明顯提高，增加了電極的電催化性能，從而提高了丙溴磷檢測的靈敏度，該傳感器在丙溴磷濃度為0.001 μmol/L～200 μmol/L時，丙溴磷濃度與峰值電流成線性關系，檢出限為0.002 μmol/L，并且實現了快速檢測，每小時可檢測200個樣品。Xu等[23]用多壁碳納米管做基質制備四環素分子印跡聚合物修飾玻碳電極，多壁碳納米管為分子印跡提供了大的表面積，為電子轉移提供了高導電性，這種方法制備的傳感器具有高靈敏度和選擇性，檢出限為0.013 μmol/L，人血清中四環素的回收率為95.7%～105.4%。

2.3 金屬-有機骨架分子印跡聚合物

金屬-有機骨架（metal-organic frameworks，MOFs），是由有機配體和金屬離子或團簇通過配位鍵自組裝形成的具有分子內孔隙的有機-無機雜化材料[24]。在MOFs中，有機配體和金屬離子或團簇的排列具有明顯的方向性，可以形成不同的框架孔隙結構，從而表現出不同的吸附性能、光學性質、電磁學性質等。MOFs具有比表面積大、孔徑可調節、結構與功能多樣性和不飽和的金屬位點等特點，在現代材料學方面呈現出巨大的發展潛力和發展前景[25]。

Xiao Yang等[26]成功制備了以ZIF-8為基質的新型分子印跡聚合物，用于在水溶液中選擇性鑒定和分離2，4-二氯苯氧基乙酸，結果表明該分子印跡聚合物的最大吸附容量為108.10 mg/g。Xu等[27]制備具有高比表面積和孔隙率的金屬-有機骨架ZIF-8，并將其用作基質在表面進行槲皮素分子印跡聚合物的制備，構建基于MOF的傳感器，然后將藍色發光碳點嵌入金屬-有機骨架作為信號轉換器，用于槲皮素的高選擇性和高靈敏度的光敏檢測隨著槲皮素濃度從0增加到50.0 μmol/L，其熒光呈線性下降，檢出限為2.9 nmol/L。乳液聚合法制備以ZIP-8為基質的分子印跡聚合物見圖2。

圖2 乳液聚合法制備以ZIP-8為基質的分子印跡聚合物Fig.2 Schematic representation of MIPs based on ZIF-8 stabilized pickering emulsions polymerization

2.4 基于熒光納米粒子的分子印跡聚合物

目前，在分子印跡領域常用的熒光納米粒子主要有量子點、碳量子點、石墨烯量子點、上轉換納米粒子等[28-30]。熒光分子印跡聚合物因其獨特的熒光效應，多被應用在光敏檢測中，利用熒光物質特有的熒光猝滅或熒光增強等效應建立快速檢測方法。量子點分子印跡聚合物的制備及熒光猝滅檢測原理見圖3。

2.4.1 量子點分子印跡聚合物

量子點是一種納米級別的半導體，直徑常在2 nm～20 nm之間，通過對這種納米半導體材料施加一定的電場或光壓，它們便會發出特定頻率的光，而發出光的頻率會隨著這種半導體尺寸的改變而變化，因而通過調節這種納米半導體的尺寸就可以控制其發出的光的顏色[31]。常見的量子點由 IV、II-VI、IV-VI或III-V族元素組成。具體的例子有硅量子點、鍺量子點、硫化鎘量子點、硒化鎘量子點、碲化鎘量子點、硒化鋅量子點、硫化鉛量子點、硒化鉛量子點、磷化銦量子點和砷化銦量子點等。

圖3 量子點分子印跡聚合物的制備及熒光猝滅檢測原理Fig.3 Preparation of quantum dot molecularly imprinted polymer and its fluorescence quenching detection principle

Anis等[32]以PEG-Mn與ZnS混合的量子點為載體制備黃曲霉毒素分子印跡聚合物，通過熒光光譜儀進行對非乳制品飲料樣品中的黃曲霉毒素進行熒光測量，制備的 MIP-QDs 復合物對 AFs（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）具有高親和力和選擇性，檢出限和定量分別為 0.016 mg/L和 0.053 mg/L，回收率為（99±4）%至（107±5）%。賈夢凡[33]利用量子點的熒光猝滅原理，成功制備了以羧基化CdTe量子點為基質的2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）分子印跡聚合物，可用于高靈敏高選擇的檢測2，4-D，檢測限最低可達2.1 nmol/L。Wang等[34]以CdS/ZnS量子點為基質制備的乙烯雌酚分子印跡聚合物對乙烯雌酚表現出高選擇性和特異性熒光猝滅，通過熒光經檢測乙烯雌酚濃度在0.002 mg/L～10.0 mg/L范圍內呈良好的線性關系，回收率在99.6%～102.0%和82.9%～95.9%之間，該檢測方法準確度和精密度高，選擇性好，實用性強，實現了在海水河水樣品中的快速檢測。

2.4.2 碳量子點分子印跡聚合物

碳量子點是一種由分散的類球狀碳顆粒組成，尺寸極?。ㄔ?0 nm以下），具有熒光性質的新型納米碳材料。碳量子的結構和組成決定了其性質的多樣性，碳量子點的主要特性是在紫外光區有較強的吸收峰，光致發光性質，上轉換發光性質等[35]。傳統的量子點一般是從鉛、鎘和硅的混合物中提取出來的，但這些量子點一般有毒，對環境也有很大的危害，碳量子點作為一種新型的碳納米材料，與各種金屬量子點類似，但在制備的過程中不涉及重金屬的使用，因此相較于金屬量子點材料，碳量子點具有較高的生物相容性和較低的細胞毒性，對環境危害很小[36]。碳量子點合適的尺寸、低廉的成本和良好的生物兼容性對于生物標記等領域的研究是至關重要的，因此它的出現引起了研究者廣泛的關注。

Ensafi等[37]用橙汁作為碳源，通過簡單綠色的方法合成水溶性熒光碳量子點，制備了以碳量子點為基質的鹽酸異丙嗪分子印跡聚合物作為光學傳感器，利用熒光猝滅原理測定鹽酸異丙嗪，該傳感器對鹽酸異丙嗪有良好的選擇性和靈敏度，檢出限為0.5 μmol/L，在人血漿樣品中對鹽酸異丙嗪的回收率為96.4%～102.3%。Liu等[38]用甘薯皮制備碳量子點具有低毒性和優異的光穩定性，以該碳量子點為基質制備的土霉素分子印跡聚合物作為一種新型的熒光探針用于特異性識別和靈敏快速檢測土霉素，利用碳量子點與土霉素結合時產生的熒光猝滅效應實現對土霉素的快速檢測，該熒光探針對土霉素的檢出限為15.3 ng/mL，對蜂蜜樣品中土霉素的回收率為90.2%～97.3%。

2.4.3 上轉換分子印跡聚合物

上轉換納米粒子（upconversion luminescent material，UCNPs）是在光激發時，通過吸收長波長低能光子而發射比激發波長短的熒光的納米材料，此過程違背Stokes定律，因此，也稱上轉換發光為逆“Stokes發光”[39]。基質材料、激活劑和敏化劑是上轉化納米材料的基本組成?；|材料自身不構成激發能級，但是可以為激活離子提供適合的晶體場；激活劑是材料中摻雜的微量稀土離子或過渡金屬離子，這些雜質離子的引入，會導致晶格產生缺陷，進而影響上轉換發光過程。敏化劑本身不發光，當被外界能量激發后，可以將能量通過共振作用傳遞給激活劑，進而增強發光效率。鑭系元素具有幾乎覆蓋從紫外線到近紅外線的整個光譜區的光譜線，是作為參雜元素最常見的材料[40]。

UCNPs因其獨特的發光機制，相較于傳統作為生物標記材料的有機染料，具有如下諸多優點[41-43]。（1）光化學性質穩定性高；（2）發光性能穩定，不受外界干擾，適合用于復雜生物樣本中的熒光標記；（3）不遵循Stokes定律，降低背景干擾，提高檢測靈敏度；（4）（近）紅外光激發，應用于生物組織樣品時，穿透性好且對生物樣品損傷低；（5）控制摻雜元素的種類和比例，可以得到不同發射波長，實現生物體系多組分同時檢測。

曹鳳珍[44]用四水醋酸釔、四水醋酸鐿和四水醋酸鉺制備出上轉換納米粒子，以上轉換納米粒子為載體制備雜色曲霉毒素分子印跡聚合物作為熒光傳感器，對雜色曲霉毒素進行熒光檢測，雜色曲霉毒素濃度在0.050 mg/L～1.000 mg/L范圍內，熒光印跡聚合物熒光增強的程度與濃度呈現出良好的線性關系，檢出限為0.013 mg/L。

2.5 磁性分子印跡聚合物

磁性分子印跡聚合物是在分子印跡聚合物的基礎上通過加入磁性物質，使磁性分子印跡聚合物可以在外加磁場的作用下，不經過離心或過濾就能實現模板分子與聚合物的快速分離[45]。Fe3O4因其無毒，制備簡單，價格便宜等優點以磁性納米粒子的形式被廣泛應用于生物學領域，然而，最初形成的Fe3O4磁性納米粒子會迅速聚集成大團簇，從而失去單個顆粒存在的獨特性質，因此，必須涂覆穩定材料，如二氧化硅、碳、貴金屬或嵌入化學惰性保護基質中[46-47]。磁性分子印跡聚合物的合成見圖4，在食品樣品檢測中使用磁性分子印跡聚合物見圖5。

圖4 磁性分子印跡聚合物的合成Fig.4 Synthesis of magnetic molecularly imprinted polymers

圖5 在食品樣品檢測中使用磁性分子印跡聚合物Fig.5 Use of magnetic molecularly imprinted polymers in food sample testing

在Fe3O4表面涂覆SiO2是避免Fe3O4磁性納米粒子團簇的比較成熟的方法之一，該方法操作簡單且試驗成本低，是目前使用較多的方法。Chen等[47]用SiO2涂覆Fe3O4，得到雙鍵改性的Fe3O4@SiO2納米粒子。以該粒子為載體制備頭孢氨芐分子印跡聚合物，并使用該聚合物作為固相萃取柱，結合HPLC-UV檢測器對豬肉和牛奶樣品進行檢測，檢出限為5.00 μg/kg。

貴金屬涂層因具有生物相容性，化學惰性，高表面能，光學和電子特性等優點，也被經常用作磁性納米粒子表面的涂覆材料[48]。Han等[49]在Fe3O4表面包覆谷胱甘肽功能化的金，并在表面制備雌二醇分子印跡聚合物，制備了一種新型分子印跡電化學傳感器，并成功應用于奶粉中磁二醇的檢測，具有良好的靈敏度、選擇性、重現性和檢測效率，在 0.025 μmol/L～10.00 μmol/L內成良好的線性關系，檢出限為2.760 nmol/L。

表面活性劑一端是非極性的碳氫鏈（烴基），與水的親和力極小，常稱疏水基；另一端則是極性基團（如-OH、-COOH、-NH2、-SO3H 等），與水有很大的親和力，故稱親水基。在磁性納米粒子表面涂覆表面活性劑可以增加其在極性溶液中使用的可能性，因此表面活性劑也是Fe3O4表面常用的涂覆材料之一[50]。Kumar等[51]開發出一種能靈敏檢測各樣品中吡蟲啉的方法，他們使用油酸涂覆的Fe3O4為載體制備的吡蟲啉分子印跡聚合物作為分離識別吡蟲啉的元素，并結合LC-MS檢測，此聚合物顯示出快速的吸附速率和優異的吸附能力，對茄子、蜂蜜樣品中的吡蟲啉的回收率為（87.3±5.0）%和（90.6±5.6）%。

石墨烯材料是Fe3O4納米粒子表面涂覆材料中常用的碳材料，在磁性納米粒子表面涂覆石墨烯材料不僅能夠保護粒子不會團聚，還能夠提供較大的比表面積，優化吸附性能[52]。Guo等[53]在Fe3O4磁性納米粒子表面涂覆石墨烯，并以改性后的磁性石墨烯納米粒子為載體制備牛血紅蛋白分子印跡聚合物，其磁性性質有益于聚合物的分離，較大的比表面積有益于對蛋白的吸附，該聚合物對牛血紅蛋白的吸附量為186.73 mg/g。

3 結論與展望

功能性納米粒子分子印跡技術是將具有優越特性的功能性的納米粒子與分子印跡技術相結合，很大程度上改進了分子印跡技術的不足。熒光型分子印跡聚合物使分子印跡聚合物在保持原來屬性的基礎上增強了靈敏度；磁性分子印跡聚合物給予了其磁敏感特性。基于石墨烯、碳納米管、MOF材料的分子印跡聚合物具有高比表面積，增強吸附性能等優點。基于目前的研究方向及研究進展，未來的研究方向可能集中在以下領域：（1）有效制備功能性納米粒子分子印跡聚合物的方法，探索有效快速大規模的制備方法可以促進其工業化生產。（2）解決磁性分子印跡聚合物可能存在漏磁現象的問題。（3）探索多種新型功能性納米粒子，將其應用于分子印跡技術中，提高檢測方法的性能。（4）功能單體的開發。新型功能單體的開發有利于不同物質，尤其是食品的分析檢測。（5）功能性分子印跡聚合物與固相萃取、熒光檢測技術、電化學檢測技術、HPLC、LC-MS及HPLC-MS等檢測技術的結合應用。