菌核側耳高產菌絲多糖的固態培養基優化

李赟，王超

1. 浙江農林大學農業與食品科學學院（杭州 311300）；2. 浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室（杭州 311300）

菌核側耳（Pleurotus tuber-regium（Fr.）Sing）是一類珍稀的食藥兩用真菌。菌核側耳的菌絲、子實體和菌核中均含有豐富的蛋白質、礦質元素、多種維生素、真菌多糖、甾體、膳食纖維等活性成分[1-2]。現代醫藥學研究發現，多糖為菌核側耳的重要活性物質之一，具有降血脂、降血壓、提高人體免疫力、止咳化痰和抗腫瘤等功效[3-5]。

自然界野生菌核側耳的子實體與菌產量較小，遠遠低于人們的需求。固態培養更接近于菌核側耳在自然界野生狀態下的生理習性，有利于菌絲的生長及活性物質的表達[6]。此次試驗以農林廢棄物竹粉和桑葉作為固體培養基主料，探索菌核側耳在此培養基上生長及高產菌絲多糖的適宜條件，并對菌絲多糖的性質進行初步分析，為菌核側耳人工培育及其精深加工，為竹產業的循環發展，提供重要的基礎數據和參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌核側耳，購自中國普通微生物菌種保藏中心，4 ℃保存于PDA斜面培養基上；竹粉，取自浙江臨安板橋竹材加工廠，分攤曬干后，除去竹蔑等雜物，包裝備用；桑葉，采摘自浙江農林大學東湖校區林場，去除病殘葉片，清洗，在50 ℃烘箱中烘干2 h，剪碎備用。

果糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖等試劑均為分析純。

斜面培養基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然。

液態種子培養基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO41 g/L，VB10.01 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，pH自然。

固態基礎培養基：竹粉60 g，按KH2PO41 g/L、VB10.01 g/L的濃度溶解于水中，固態基質的初始含水率60%，pH自然。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫療設備有限公司）；旋轉蒸發儀RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）；HH-4型數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；恒溫培養箱（上海金平）；低溫冷凍離心機（艾本德中國有限公司）；UV-5500紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）。傅里葉變換紅外光譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；高效液相凝膠色譜儀（美國懷雅特技術公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 液態種子培養

挑選長勢良好的斜面菌種轉接到殺菌冷卻后裝有150 mL液體種子培養基的三角瓶中，在25 ℃，120 r/min條件下恒溫培養4 d，用無菌紗布過濾后得菌懸液，備用。

1.3.2 單因素研究

1.3.2.1 固態培養基質配比的研究

固態培養基質選擇竹粉和桑葉，以菌絲生長態勢和菌絲多糖含量為指標，考察竹粉和桑葉最適宜的質量比。試驗共分5組，每組中竹粉和桑葉的總質量均為60 g。Ⅰ組，竹粉60 g、桑葉0 g；Ⅱ組，竹粉40 g、桑葉20 g；Ⅲ組，竹粉30 g、桑葉30 g；Ⅳ組，竹粉20 g、桑葉40 g；Ⅴ組，竹粉0 g、桑葉60 g。

在500 mL三角瓶中分別裝入固態培養基質（按上述比例，共60 g），不另外添加碳源、氮源、無機鹽，主要考察固態培養基質直接培養菌核側耳菌株的效果。用牛皮紙裹四層紗布封口，于121 ℃滅菌40 min，冷卻至室溫后，每瓶基質中接入10 mL活化后的菌懸液，培養基初始含水率60%，于28 ℃恒溫培養20 d，取出帶有菌絲的固態基質，進行分析測定[7-8]。

1.3.2.2 外加碳源的研究

根據1.3.2.1的研究結果，改變培養基中的碳源，研究碳源對菌絲多糖含量的影響[8]。分別按照基質干質量（60 g）的2%，即1.2 g果糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖溶解到90 g純凈水中，以菌絲多糖含量為指標，考察最適宜的外加碳源種類。

1.3.2.3 外加氮源的研究

根據1.3.2.1的研究結果，改變培養基中的氮源[9]，研究氮源對菌絲多糖含量的影響。將牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米粉、黃豆粉單一氮源，分別按照基質干質量的0.5%，即0.3 g添加到60 g固態基質中，調整培養基初始含水率為60%，以菌絲多糖含量為指標，考察最適宜的外加氮源種類。

1.3.2.4 外加無機鹽的研究

根據1.3.2.1的研究結果，改變培養基中的無機鹽[10]，將KCl、MgSO4、ZnSO4、FeCl2和CaCl2分別按照基質干質量的0.05%，即0.03 g分別溶解到90 g純凈水中，以菌絲多糖含量為指標，考察最適宜的外加無機鹽種類。

1.3.3 正交試驗研究

以菌核側耳菌絲多糖含量為指標，采用正交試驗，考察固態培養基質（竹粉和桑葉的配比）、外加碳源、外加氮源和外加無機鹽4個因素的交互作用，因素水平設計見表1。

表1 正交試驗的因素水平設計（L9(34)）

1.3.4 菌絲生物量的測定

將發酵20 d后的固體菌絲從固體培養基中分離，過篩除去基質粉末，于60 ℃恒溫干燥72 h，用粉碎機粉碎后稱重[11]。

1.3.5 菌絲多糖的提取

取10 g干燥的菌絲體，按照每克菌絲體加20 mL純凈水的比例，加入200 mL的純凈水，在90 ℃下水浴提取2 h，將浸提液以8 000 r/min離心20 min，保存上清液。取離心后的殘渣，按照每克殘渣加20 mL純凈水的比例加入純凈水，在90 ℃下水浴提取2 h，浸提液以8 000 r/min離心20 min，取上清液。將2次上清液合并，置于旋轉蒸發儀中減壓濃縮至50.0 mL左右，再將濃縮液和95%的乙醇按1∶4（V/V）的比例混合，醇沉過夜，以4 000 r/min離心20 min，將沉淀物依次用無水乙醇、丙酮潤洗3～4次，干燥，獲取菌核側耳菌絲多糖[12-13]。

1.3.6 菌絲多糖含量的測定

先按苯酚硫酸法繪制標準曲線[14]；再稱取1菌絲多糖，用50 mL蒸餾水溶解，吸取2 mL，加入1 mL體積分數為5%的苯酚溶液，再加入5 mL濃硫酸，迅速振蕩均勻。室溫下靜置10 min，在490 nm處測定吸光度，計算菌絲多糖含量。

1.3.7 傅里葉紅外檢測菌絲多糖

將菌絲多糖置于40 ℃烘箱中干燥，稱取2 mg加入200 mg的溴化鉀進行壓片，然后進行紅外光譜測定，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.8 GPC測菌絲多糖的相對分子質量

稱取20 mg菌核側耳菌絲多糖，溶于超純水中，上機檢測。色譜條件：色譜柱，Shodex OHpak系列SB-806串803；流速，1 mL/min；流動相，水和0.02%疊氮化鈉；柱溫，40 ℃；進樣量，500 μL。

1.4 數據處理

試驗重復3次，數據利用SPSS 19.0分析，采用Origin 2017軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素研究結果

2.1.1 固態培養基質配比對菌核側耳生長的影響

從表2可以看出，當竹粉與桑葉質量比為2∶1時，菌絲生長狀態最好：菌絲潔白致密，纏繞盤結于料層內部，有利于后期形成菌核；而單一使用竹粉和桑葉時，菌絲發滿培養料層的時間偏長，菌絲略黃，菌絲不夠致密，這可能是單一的基質不能供給足夠的營養物質，當竹粉與桑葉質量比為2∶1時，其內部的碳、氮等物質有利于菌絲的生長。

表2 基質種類對菌核側耳菌絲萌發及生長的影響

從圖1可以看出，當竹粉與桑葉質量比為2∶1配比時，菌絲多糖含量最高，這表明良好的菌絲生長為多糖等活性物質的分泌表達奠定了良好的生物學基礎。因此，在后續單因素試驗中，固態培養基質中竹粉與桑葉的質量比為2∶1。

圖1 固態培養基質對菌核側耳產菌絲多糖的影響

2.1.2 外加碳源對菌核側耳產菌絲多糖的影響

從圖2可以看出，碳源對菌核側耳產菌絲多糖有不同的影響，果糖和葡萄糖均有較好的促進作用，甘露糖次之，半乳糖最差。從經濟角度考慮，選定葡萄糖為最優碳源。

圖2 外加碳源對菌核側耳產菌絲多糖的影響

2.1.3 外加氮源對菌核側耳產菌絲多糖的影響

從圖3可以看出，外加無機氮源和有機氮源對菌核側耳產菌絲多糖均有一定的促進作用。其中，酵母粉促進效果最好，菌絲多糖含量為7.6 mg/g，蛋白胨和牛肉膏促進效果相似，菌質多糖含量均為7.1 mg/g，使用黃豆粉和玉米粉后的結果分別為6.8和6.7 mg/g。分析其原因：固態培養過程中，菌絲匍匐伸展，因此基質的疏松狀態對菌絲生長至關重要。添加酵母粉的發酵基質相對疏松，黏結程度不高，有利于菌絲獲取營養成分和生長。

2.1.4 添加無機鹽對菌核側耳產菌質多糖的影響

從圖4可以看出，金屬離子對菌核側耳產菌絲多糖有一定的促進或抑制作用。K+、Mg2+、Zn2+有促進作用，其中Zn2+最好，因此選擇Zn2+作為外加金屬離子。

圖3 外加氮源對菌核側耳產菌絲多糖的影響

圖4 添加無機鹽對菌核側耳產菌絲多糖的影響

2.2 正交試驗研究結果

根據單因素試驗結果，對竹粉和桑葉質量比、外加碳源、外加氮源、無機鹽進行四因素三水平（L9(34)）正交試驗，結果見表3。

極差分析表明，影響菌核側耳產菌絲多糖的主次因素為D＞A＞C＞B，最優組合為A3B1C1D2，即竹粉與桑葉質量比2∶1、葡萄糖用量1%、酵母粉用量0.25%、Zn2+用量0.05%。

表3 正交試驗結果

2.3 菌核側耳產菌絲多糖的驗證試驗結果

因最優組合A3B1C1D2并不在正交試驗表中，按照A3B1C1D2，在菌懸液接種量10%，培養基初始含水率60%條件下28 ℃恒溫培養20 d，結果如圖5所示。

從圖5可以看出，菌核側耳在優化后的培養基中，培養前10 d生長緩慢，在菌絲發滿料層的底層后，生長迅速，在第16天發滿整個培養料層；菌絲多糖的含量也隨著菌絲的粗壯、纏繞盤結而增多，在第18和第19天時達到最高，每瓶培養料中菌絲生物量（干質量）可達155 mg，菌絲多糖含量達13.8 mg/g。

圖5 菌核側耳產菌絲多糖驗證試驗結果

2.4 菌核側耳菌絲多糖的紅外光譜分析

從圖6可以看出，波數3 424.73 cm-1處的吸收峰強而且寬，是O—H的伸縮振動[15]；波數2 928.13 cm-1為CH2或CH上的C—H的伸縮振動；波數1 653.07 cm-1處為糖醛酸中羰基C＝O鍵非對稱的伸縮振動峰[16]；波數1 401.63 cm-1為C—H彎曲振動吸收峰；波數1 200～1 000 cm-1吸收峰是由糖環上或糖苷鍵上C—O—C伸縮振動所引起的[17]；波數973.22 cm-1為吡喃環的吸收峰[18]。

圖6 菌絲多糖紅外光譜

2.5 菌核側耳多糖的分子摩爾質量

從圖7可以看出，光散射和示差檢測器所產生的峰的大小和形狀幾乎重合，這表明2種檢測器間的延遲已被準確地確定。菌核側耳菌絲多糖的出峰時間為12.13～35.83 min，菌核側耳菌絲多糖的重均分子摩爾質量MW為4.751×104g/mol，數均分子摩爾質量Mn為2.880×104g/mol，最高峰分子摩爾質量（峰尖分子摩爾質量）Mp為3.488×104g/mol，Z均分子摩爾質量MZ為1.126×106g/mol，MW/Mn的值為1.649，表明菌核側耳的菌絲多糖是一類中等分布聚合物。

圖7 菌絲多糖分子摩爾質量譜圖

如圖8所示，在重均分子摩爾質量分析的基礎上，采用ASTRA軟件對4個分子摩爾質量劃分區間的菌核側耳菌絲多糖的分子摩爾質量進行統計分析，4個分子摩爾質量劃分的區間分別為：200～2.6×104，2.6×104～7.5×104，7.5×104～2.6×105和2.6×105～9.6×105g/mol。菌核側耳菌絲多糖分子摩爾質量分布情況如表4所示，菌絲多糖大部分分布在2.6×104～7.5×104g/mol之間，占其總分子數量的84.8%。

圖8 菌絲多糖分子摩爾質量分布圖

表4 菌絲多糖分子摩爾質量分布表

3 結論

1) 對菌核側耳固態培養的條件進行了分析和優化，獲得了最佳培養條件，即竹粉與桑葉質量比2∶1、葡萄糖用量1%、酵母粉用量0.25%、Zn2+用量0.05%，菌懸液接種量10%，培養基初始含水率60%，28 ℃恒溫培養20 d，每瓶培養料中菌絲生物量（干質量）可達155 mg，菌絲多糖含量達13.8 mg/g，這為人工培育菌核側耳產菌絲多糖提供了重要的參考依據。

2) 對菌核側耳菌絲多糖進行了初步分析，結果表明，該多糖屬于一種吡喃糖，重均分子摩爾質量MW為4.751×104g/mol，是一種中等分布聚合物，大部分分布在2.6×104～7.5×104g/mol之間，占其總分子摩爾質量的84.8%。這為后續深入研究菌核側耳菌絲多糖的結構、功能及生物活性奠定了一定的工作基礎。