超聲波-過氧化氫優(yōu)化甘草酸提取工藝

高少雄，于波，鄭曉宇

中國石油大學(xué)（北京）理學(xué)院（北京 102249）

甘草是中國傳統(tǒng)中草藥中需要量最龐大的藥材之一。中醫(yī)認(rèn)為甘草具有益氣補中、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛 、緩和藥性等功效[1]，是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食同源食物之一[2]。甘草在中國資源豐富、種植廣泛，在西北、東北、華北地區(qū)均有分布[3]。因此甘草的開發(fā)具有重要經(jīng)濟(jì)價值。甘草酸是甘草中的主要活性成分，是一種三萜皂苷類物質(zhì)，除具有止咳、保肝、抗病毒等藥用作用[4]外，也是甘草甜味的主要來源，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最好的天然甜味劑[5]。而甘草酸的各鹽類也廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、飲料[6]、化妝品等領(lǐng)域，尤其是其銨鹽具有調(diào)節(jié)免疫[7]、抗氧化、消除氧自由基、穩(wěn)定膜等作用[8]，拓寬甘草酸的應(yīng)用前景。正因如此，甘草酸提取過程中，增加其提取率有著重要意義。

常用的甘草提取方法主要包括傳統(tǒng)的浸漬法、升華法、水蒸氣蒸餾法[9]、熱回流法、索氏提取法等[10]，其提取的本質(zhì)是甘草酸由甘草細(xì)胞內(nèi)部溶解到固液界面再向溶劑主體擴(kuò)散的傳質(zhì)過程[11]。因此改善傳質(zhì)過程中的動力與阻力可有效增加提取率，如超聲強化提取機(jī)理就是利用超聲波的沖流、湍流、機(jī)械振動、細(xì)胞破壁、空化等作用加速甘草酸向溶劑中的擴(kuò)散，來促進(jìn)整個提取過程[12]。甘草細(xì)胞壁是甘草酸提取過程中主要的傳質(zhì)阻力，若能降解構(gòu)成細(xì)胞壁的主要物質(zhì)木質(zhì)素[13]，從而使細(xì)胞壁被破壞，便能達(dá)到降低傳質(zhì)阻力，提高提取率目的。木質(zhì)素在生物界主要由酶降解，有研究表明可通過稀酸或超聲波過氧化氫降解木質(zhì)素[14-15]。

試驗在超聲提取基礎(chǔ)上，以過氧化氫和乙酸形成過氧酸體系模擬木質(zhì)素過氧化酶降解木質(zhì)素，降低傳質(zhì)阻力，通過正交與效應(yīng)面試驗確定最佳優(yōu)化條件，提高提取率，為工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥材

甘草采摘于新疆克拉瑪依，60 ℃干燥至恒質(zhì)量，粉碎機(jī)粉碎后，過孔徑0.425 mm篩之后備用。

1.1.2 儀器與試劑

JYS-M01研磨粉碎機(jī)（九陽股份有限公司）；數(shù)控標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩分機(jī)（新鄉(xiāng)市倍力特振動機(jī)械有限公司）；DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；智能數(shù)控超聲波發(fā)生器（杭州成功超聲電源技術(shù)有限公司）；PHSJ-4A型實驗室pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DTS-7型自動平衡離心機(jī)（北京時代北利離心機(jī)有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；UV-2550紫外分光光度計（日本島津公司）。

甘草酸分析對照品（上海麥克林生化科技有限公司，純度大于98%）；無水乙醇、冰乙酸、30%過氧化氫（均為分析純）。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘草酸提取

稱取3 g甘草粉末，加入60 mL一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的過氧化氫水溶液，逐滴滴加50%乙酸溶液，調(diào)節(jié)pH 4.5～5.0之間，進(jìn)行超聲提取，提取液離心，收集上清液，將沉淀物烘干，以60%乙醇為提取劑，80 ℃，120 W進(jìn)行二次超聲提取2 h，過濾二次提取液。分別測量2次提取液的吸光度，計算總收率。

1.2.2 甘草酸含量測定

稱取0.020 g甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品，使用70%乙醇定容于25 mL容量瓶，得到0.08 mg/mL甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別精密移取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，同樣以70%乙醇定溶于25 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度0.032，0.048，0.064，0.080和0.096 mg/mL的甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，記為1～5號樣品。使用70%乙醇為空白溶液，使用紫外分光光度計在200～400 nm處掃描，分別測量1～5號樣品的吸光度。對不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液在最大吸收波長處的吸光度做二元回歸得到甘草酸濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以對照品溶液及供試品溶液進(jìn)行精密度及重復(fù)性測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草酸含量測定

2.1.1 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

如1.2.2的方法在200～400 nm區(qū)間內(nèi)測量1～5號甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度曲線如圖1所示。

圖1 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外吸收曲線

受朗伯比爾定律影響，甘草酸最大吸收波長在240 nm左右，以最大吸光度為縱坐標(biāo)，甘草酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，使用二元回歸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

圖2 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸處理，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（1）。

2.1.2 精密度試驗

移取1.2.2中配制的0.08 mg/mL甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液3.5 mL于50 mL容量瓶中，使用70%乙醇定容后，搖勻，測量其240 nm附近的最大吸光度，分別測定6次。6次測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%，說明具有良好精密性。

2.1.3 重復(fù)性試驗

取1.1.1中的供試甘草粉末5 g，80 ℃下70%乙醇提取2 h。移取所得的提取液3.5 mL于25 mL容量瓶中，70%乙醇定容后測量240 nm附近最大吸光度，分別測定6次，6次測量結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.21%，具有良好重復(fù)性。

2.1.4 提取率計算

移取0.5 mL提取液于25 mL容量瓶中，使用70%乙醇定容，測定其240 nm左右的最大吸光度，按照回歸方程（1）計算甘草酸質(zhì)量濃度C。甘草酸提取率計算按式（2）計算。

式中：n為提取液稀釋倍數(shù)；C為由回歸方程（1）所得甘草酸質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；m為所用供試藥材的質(zhì)量，mg。

2.2 空白試驗

稱取3 g甘草粉末，加入60 mL的60%乙醇溶液，80 ℃，120 W下超聲提取2 h，抽濾后測量提取液吸光度，計算提取率，重復(fù)3次，平均提取率為13.61%。

2.3 單因素試驗

2.3.1 過氧化氫含量的影響

分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，6%，9%，12%和15%的過氧化氫溶液按照1.2.1方法進(jìn)行初次提取，固定提取溫度60 ℃，提取功率120 W，提取時間2 h。結(jié)果如圖3所示，甘草酸提取率隨過氧化氫含量增加先上升后下降，在9%處最大為18.09%。過氧酸體系形成后，降解木質(zhì)素，細(xì)胞壁被破壞，傳質(zhì)阻力降低，從而使提取率增大，但隨著過氧化氫含量進(jìn)一步增大，其強氧化性會破壞甘草酸結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率降低。

圖3 過氧化氫含量對甘草酸提取效果的影響

2.3.2 超聲波提取時間的影響

按照1.2.1初次提取方法，固定提取溫度60 ℃，提取功率120 W，使用6%過氧化氫溶液分別提取1，2，3，4和5 h。結(jié)果如圖4所示，在2 h處有最大提取率16.68%。繼續(xù)提取，雖然過氧酸體系可以更充分地降解木質(zhì)素，但由于外部提取液的甘草酸含量逐漸大于細(xì)胞內(nèi)部，形成濃度差，反而增加傳質(zhì)阻力，減小提取率。

圖4 超聲波提取時間對甘草酸提取效果的影響

2.3.3 超聲波提取溫度的影響

分別在40，50，60，70和80 ℃下按照1.2.1進(jìn)行初次提取，功率120 W，提取時間2 h，過氧化氫含量6%，結(jié)果如圖5所示，提取率隨溫度升高而提高，在70 ℃達(dá)到峰值18.36%，超過70 ℃后則急劇減小。可見隨著溫度升高過氧酸體系降解木質(zhì)素作用加強，傳質(zhì)阻力降低，且甘草酸溶解度隨溫度升高而升高，使得初次提取率增加，進(jìn)而提高總收率，但隨著溫度進(jìn)一步升高，甘草酸結(jié)構(gòu)被破壞，收率隨之大幅下降。

圖5 超聲波提取溫度對甘草酸提取效果的影響

2.3.4 超聲波功率的影響

按照1.2.1的提取方法，固定溫度70 ℃，時間2 h，使用6%過氧化氫溶液，分別在90，105，120，135和150 W下進(jìn)行初次提取。提取率先升高后減小，在120 W處有最大收率18.36%。最開始，超聲波功率較弱，過氧酸體系不能夠打開各種化學(xué)鍵降解木質(zhì)素，但隨著功率的增加，過氧酸體系的作用越來越強，但超過120 W時，由于原料的量較少，超聲波不完全作用于原料上，從而造成“空超”現(xiàn)象，甚至破壞甘草酸結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致收率下降。

2.4 正交試驗

對影響甘草酸提取的4個因素超聲溫度（A）、超聲功率（B）、過氧化氫含量（C）、超聲時間（D）進(jìn)行優(yōu)化，采取L9(34)正交設(shè)計進(jìn)行試驗，考察因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。4個影響因素對提取率影響的主次為：功率（B）＞溫度（A）＞過氧化氫含量（C）＞提取時間（D）。其中，提取時間（D）在所選因素水平上影響較小，可對另3種因素進(jìn)行進(jìn)一步考察。正交試驗給出的最佳提取條件為A2B2C2D1，即70 ℃、120 W下，使用9%的過氧化氫溶液進(jìn)行初次提取2 h。離心分離后，收集上清液，并將沉淀物烘干后，在80 ℃、120 W下使用60%乙醇進(jìn)行二次超聲提取2 h，抽濾后收集濾液，2次提取的甘草酸之和即為總收率。

圖6 超聲波功率對甘草酸提取效果的影響

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果

2.5 效應(yīng)面試驗

2.5.1 試驗結(jié)果

在正交試驗的基礎(chǔ)上，使用Box-Behnken效應(yīng)面法原理進(jìn)行試驗設(shè)計，選取超聲溫度、超聲功率、過氧化氫含量3個自變量，甘草酸提取率為效應(yīng)值設(shè)計三因素三水平效應(yīng)面分析試驗，其中包括12個析因點和5個中心點，共計17個試驗點。試驗方案及結(jié)果見表3和表4。方差分析表見表5。

表3 效應(yīng)面法分析因子及水平

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果

表5 方差分析表

2.5.2 模型建立與顯著性分析

使用Design Expert 10.0對表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行效應(yīng)面分析，得到二元回歸方程（3）。

且從表5中可知模型的p＜0.000 1（＜0.01），具有較好顯著性，而失擬項的p=0.556 1（p＞0.5）不顯著，同時該模型R2=0.978 8，即97.88%的效應(yīng)值變化來源于所選因素。數(shù)據(jù)說明，模型的擬合度良好，該模型可用于表示各自變量與效應(yīng)值之間的多元關(guān)系。

各影響因素中，一次項中提取功率（B）具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01），同時各因素交互作用不顯著，而二次項中B2、C2（功率與功率的交互作用、溫度與溫度的交互作用）具有統(tǒng)計學(xué)意義。從F值可知對甘草酸提取率影響大小順序為提取功率＞提取溫度＞過氧化氫含量，與正交試驗所得結(jié)果相同。

2.5.3 效應(yīng)面交互作用分析

以過氧化氫含量、超聲功率、超聲溫度中的兩者為X和Y軸，以甘草酸提取率為Z軸，使用Design Expert 10.0作出對應(yīng)的三維圖，通過效應(yīng)曲面和等高線可較為直觀的反映各因素的交互作用。曲面越陡峭，則該因素影響越大。由圖7～圖9可知，響應(yīng)曲面均是開口朝下的凸面，等高線近似圓形，中心處于考察區(qū)域內(nèi)，說明在考察區(qū)域內(nèi)存在最大效應(yīng)值，其中圖8，即超聲溫度與過氧化氫濃度的效應(yīng)曲面相對平緩，說明其交互作用相對較弱。

圖8 超聲溫度和過氧化氫濃度對甘草酸提取效果影響的效應(yīng)曲面

圖9 超聲溫度和超聲波功率對甘草酸提取效果影響的效應(yīng)曲面

2.5.4 最佳提取條件確定與驗證

由Design Expert 10.0得出最佳提取條件為：過氧化氫含量8.65%、超聲功率124.45 W、提取溫度68.83℃。修正為過氧化氫含量8.7%、超聲功率124 W、提取溫度68 ℃。以此條件通過1.2.1中方法進(jìn)行提取，平行3次試驗，所得提取率平均值為18.91%，與理論提取率相差2.9%，可見，該二元方程所建立效應(yīng)面模型預(yù)測可行。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，超聲提取過程中，加入過氧化氫與乙酸形成過氧酸體系可以有效地降解木質(zhì)素，從而破壞細(xì)胞壁，降低甘草酸提取過程中的傳質(zhì)阻力，提高提取率。正交試驗與效應(yīng)面試驗結(jié)果表明，過氧化氫含量8.7%，超聲功率124 W，提取溫度68 ℃時，提取時間2 h，經(jīng)二次提取后可以最大程度提高提取率，達(dá)到18.91%，相比于一般的超聲提取，可增加提取率3.3%。

雖然工藝尚未進(jìn)行放大試驗，且存在成本較高等問題，但研究表明，方法可有效提升甘草酸收率，為后續(xù)該工藝的工業(yè)化奠定理論基礎(chǔ)。