以蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活性評價淡豆豉發酵工藝

王萍，陳麗艷，孫銀玲，任善崇，曹陽，王偉明

黑龍江省中醫藥科學院（哈爾濱 150036）

淡豆豉是以大豆為原料，以青蒿、桑葉為輔料，經發酵加工而成的藥食同源類中藥。淡豆豉的發酵過程中有多種微生物共同參與而產生多種酶，其中，蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活性是衡量淡豆豉品質的重要指標。蛋白酶可將大豆中的蛋白質水解成肽類和游離氨基酸等小分子，提高生物活性和利用度[1-2]；β-葡萄糖苷酶可將基質中的異黃酮糖苷水解成游離型苷元而被人體吸收利用[3-4]。淡豆豉的傳統生產工藝為自然發酵，受生產環境、季節等因素的影響導致品質不穩定、工藝不可控，也易受到有害菌污染，如產生引起人、畜肝臟致癌的黃曲霉毒素等，引起醫藥界的廣泛關注[5]。因此，采用純菌種發酵制備淡豆豉，考察淡豆豉動態發酵過程蛋白酶和β-葡萄糖苷酶的活性變化，篩選淡豆豉的最佳制備工藝，為保證淡豆豉品質及用藥的安全有效提供依據。

1 材料與發放

1.1 菌種來源

淡豆豉（批號170701，黑龍江德順長中藥飲片有限公司；批號170402，山東舜生堂中藥飲片有限公司）。試驗采用前期從市售淡豆豉中分離的優勢菌種，命名為SSP-I和SSP-II。經鑒定，SSP-I是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），SSP-II是傘枝梨頭霉（Absidia corymbifera [John] Saccardo Trotter）。另一株是標準菌株米曲霉（CICC 2014Aspergillus oryzae，中國工業微生物菌種保藏中心[6]）。

1.2 材料與試劑

福林酚試劑（批號20170218，北京博奧拓達）；酪蛋白CS（批號20161108，北京博奧拓達）；酪氨酸Tyr（批號20170612，北京博奧拓達）；對硝基苯酚P-NP（批號20171104，上海山浦化工有限公司）；碳酸鈉（批號20171012，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.3 主要儀器與設備

電子天平（BSA224S，賽多利斯）；電熱恒溫培養箱（DHP-9272，上海一恒科學儀器有限公司）；凍干機（LGJ-10F，北京松源華興科技發展有限公司）；離心機（LG10-2.4A，北京京立離心機有限公司），多功能酶標儀（M200，TECAN）。

1.4 方法

1.4.1 淡豆豉的制備

1.4.1.1 發酵菌液的制備

將SSP-I菌接種于營養瓊脂試管斜面上，于37 ℃培養18～24 h。將SSP-II菌和CICC2014菌分別接種于PDA試管斜面上，于28 ℃培養3～5 d。用無菌生理鹽水將斜面上菌落沖洗混勻制成菌懸液，濃度109CFU/mL，備用[7]。

1.4.1.2 發酵工藝

取青蒿7 g、桑葉10 g，加水煎煮，濾過，煎煮液拌入100 g凈大豆中，待吸盡后，裝袋，121 ℃高壓滅菌40 min，放涼，備用[14]。按表1分別接種1.4.1.1的菌液1 mL，搖勻，先于37 ℃培養7 d（前酵），平行樣品各取出一份，另一份移置42 ℃[8-11]培養15 d（后酵），取出，備用。具體發酵條件見表1。

表1 不同菌種發酵淡豆豉前酵、后酵溫度及發酵時間

1.4.2 淡豆豉蛋白酶活性測定

1.4.2.1 酪氨酸標準溶液配制

酪氨酸（Tyr）在105 ℃干燥至恒質量，精密稱取0.1 g，加1 mol/L HCl溶液6 mL溶解，0.2 mol/L HCl溶液定容至100 mL容量瓶，得100 μg/mL Tyr標準儲備液。精密吸取標準溶液，分別稀釋為80，60，40和20 μg/mL Tyr標準溶液，得線性范圍為20～100 μg/mL的質量濃度梯度標準溶液。Tyr標準溶液各40 μ L，加入0.4 mol/L Na2CO3溶液200 μL后，加福林酚試劑40 μL，40 ℃水浴20 min，采用多功能酶標儀于660 nm測定OD值[12-13]。

1.4.2.2 供試品溶液制備

精密稱取淡豆豉10 g，加無菌生理鹽水50 mL，研磨，離心15 min，2次，上清液作為供試品溶液[14]。精密吸取取供試品溶液和0.02 g/mL酪蛋白（CS）溶液各50 μL，40 ℃水浴2 min后混勻，水浴10 min，加入三氯乙酸（TCA）溶液100 μL，混勻，40 ℃水浴20 min，離心。取上清液40 μL加0.4 mol/L Na2CO3溶液200 μL，混勻，加福林酚試劑40 μL混勻，40 ℃水浴20 min，測定OD值。

1.4.2.3 空白對照溶液制備

取淡豆豉供試品溶液50 μL，勿加酪蛋白（CS）溶液，其他處理同1.4.2.2。

1.4.3 淡豆豉β-葡萄糖苷酶活性測定

1.4.3.1 對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷溶液的配制

精密稱取對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（P-NPG）30.13 mg，加0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至100 mL容量瓶，得1 000 μmol/L P-NPG溶液。

1.4.3.2 對硝基苯酚標準溶液的配制

精密稱取對硝基苯酚（P-NP）1.39 mg，加0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至100 mL容量瓶，得100 μmol/L的P-NP標準溶液。精密吸取P-NP標準溶液，分別稀釋為10，20，30，40，50和60 μmol/L標準溶液，得線性范圍為10～100 μmol/L的濃度梯度標準溶液。于400 nm測定OD值。

1.4.3.3 供試品溶液制備

精密吸取P-NPG溶液120 μL，45 ℃水浴5 min，加入1.4.2.2的淡豆豉供試品溶液30 μL，45 ℃水浴10 min，加入1 mol/L Na2CO3溶液150 μL中止反應，于400 nm下測定OD值。

1.4.3.4 空白對照溶液制備

精密吸取1.4.2.2的淡豆豉供試品溶液30 μL，45℃水浴10 min，加入1 mol/L Na2CO3溶液150 μ L中止反應，于400 nm下測OD值。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

1個酶活力單位是指在特定條件（25 ℃，其他為最適條件）下，在1 min內能轉化1 μ mol底物的酶量，或是轉化底物中1 μmol的有關基團的酶量[15-17]。結果見圖1。

經分析得到蛋白酶標準曲線為Y=0.005 8X+0.073 9（R2=0.994 1），表明Tyr質量濃度20～100 μg/mL呈良好線性關系。

經分析得到β-葡萄糖苷酶活的標準曲線為Y=0.007 6X+0.059 2（R2=0.998 6），表明P-NP濃度10～100 μmol/L呈良好線性關系。

圖1 蛋白酶標準曲線

圖2 β-葡萄糖苷酶標準曲線

2.2 淡豆豉蛋白酶活性測定結果

根據線性回歸方程及樣品的OD值，計算出按表1發酵條件所得到的淡豆豉樣品的蛋白酶活性，結果見圖3和圖4。

圖3 黃豆前酵和后酵蛋白酶活性動態變化趨勢圖

圖4 黑豆前酵和后酵蛋白酶活性動態變化趨勢圖

單菌種發酵樣品蛋白酶活性測定結果表明，1號菌接種至黑豆發酵13 d，酶活為1 590.24 IU/g，接種至黃豆發酵10 d，酶活為1 379.00 IU/g；2號菌接種至黑豆發酵19 d，酶活為1 182.82 IU/g，接種至黃豆發酵16 d，酶活為1 035.06 IU/g；3號菌接種至黑豆發酵7 d，酶活為1 040.33 IU/g，接種至黃豆發酵7 d，酶活為818.25 IU/g。即采用1號菌、以黑豆為基質發酵制備淡豆豉蛋白酶活性最高，但以黑豆為發酵基質的淡豆豉蛋白酶活性與黃豆相比，降低了211.24 IU/g，如從成本考慮亦可采用黃豆為基質發酵。

雙菌種發酵樣品蛋白酶活性測定結果表明，4號菌分別接種至黑豆或黃豆發酵19 d，酶活分別為1 152.51和996.83 IU/g；5號菌接種至黑豆發酵3 d，酶活為1 249.53 IU/g，接種至黃豆發酵16 d，酶活僅為673.22 IU/g；6號菌接種至黑豆發酵10 d酶活達1 050.27 IU/g，而接種至黃豆發酵22 d，酶活為791.25 IU/g。由此可知，雙菌種組合發酵制備淡豆豉，黑豆作為發酵基質優于黃豆，采用5號菌最佳。

因此，以蛋白酶活性為考察指標確定淡豆豉的最佳工藝為：以黑豆為基質，枯草芽孢桿菌為發酵菌種，于37 ℃前酵7 d，于42 ℃后酵6 d。

2.3 淡豆豉樣品β-葡萄糖苷酶活性測定結果

根據標準曲線及樣品的OD值，計算出按表1發酵條件所得到的淡豆豉樣品中的β-葡萄糖苷酶活性，結果見圖5和圖6。

圖5 黃豆前酵和后酵動態β-葡萄糖苷酶活性變化趨勢圖

圖6 黑豆前酵和后酵動態β-葡萄糖苷酶活性變化趨勢

單菌種發酵樣品β-葡萄糖苷酶活性結果顯示，1號菌接種至黑豆發酵19 d，酶活為23.39 IU/g，接種至黃豆發酵22 d，酶活為7.84 IU/g；2號菌接種至黑豆發酵13 d，酶活為27.96 IU/g，接種至黃豆發酵19 d，酶活為19.70 IU/g；3號菌接種至黑豆發酵19 d，酶活為16.41 IU/g，接種至黃豆發酵22 d，酶活為11.69 IU/g。即黑豆作為發酵基質優于黃豆，2號菌種最佳。

雙菌種發酵樣品β-葡萄糖苷酶活性結果顯示，4號菌分別接種至黑豆和黃豆發酵22 d，酶活分別為7.94和11.15 IU/g；5號菌接種至黑豆發酵7 d，酶活為12.22 IU/g，接種至黃豆發酵10 d，酶活為23.80 IU/g；6號菌接種至黑豆發酵10 d，酶活為47.15 IU/g，接種至黃豆發酵22 d，酶活為16.59 IU/g。即黑豆作為發酵基質優于黃豆，6號菌種最佳。

因此，若以β-葡萄糖苷酶活性為衡量指標，淡豆豉最佳發酵條件為：以黑豆為基質，以傘枝梨頭霉和米曲霉雙菌種為發酵菌種，于28 ℃前酵7 d，經42 ℃后酵3 d。

3 討論

3.1 酶活性對淡豆豉的影響

淡豆豉含有大豆異黃酮類、大豆低聚糖、大豆皂苷、大豆多肽、褐色素、γ-氨基丁酸、豆豉纖溶酶等成分，具有廣泛的藥理作用[18-20]，淡豆豉異黃酮中糖苷型異黃酮是由游離型異黃酮與一分子的葡萄糖以7-位氧苷鍵結合的產物，天然苷類的分子結構并不是其活性發揮的最佳狀態，需在腸道微生物的作用下轉化為苷元被吸收利用，而淡豆豉在炮制過程中，在β-葡萄糖苷酶的作用下，就能夠使糖苷型異黃酮的葡萄糖基團脫掉，由結合糖苷型轉化為游離型苷元[21-23]；淡豆豉中的大豆多肽多是指以大豆為原料經Aspergillus oryzae、Bacillus subtilis等微生物產生的蛋白酶作用下分解為多低聚肽類物質，通常由3～6個氨基酸組成，還包括一些游離氨基酸、少量糖類等[24]。因此β-葡萄糖苷酶和蛋白酶的活性作為其發酵過程控制指標，具有重要意義，故試驗采用2種酶活作為淡豆豉品質的衡量指標，經研究得到活性較高的淡豆豉的純菌種發酵條件，為多功能型淡豆豉的生產提供依據。

3.2 發酵基質與菌種對淡豆豉的影響

傳統的淡豆豉制備多采用黑豆作為發酵基質，而納豆、天培等具有保健作用的大豆發酵食品是以黃豆作為發酵基質來制備[25]。《藥典》中規定為大豆，并未明確黑豆或黃豆等，因此本研究對比考察黑豆、黃豆發酵制備淡豆豉，結果發現，黑豆作為發酵基質稍優于黃豆，同一菌種、不同發酵基質制備淡豆豉蛋白酶活性變化趨勢基本一致，但β-葡萄糖苷酶活性的變化趨勢相差較大，尚需進一步研究。菌種是中藥發酵的基本工具，也是決定發酵產品品質和療效的關鍵影響因素。不同菌種產生的酶系及活性不同，對發酵基質營養物質的利用及對活性物質的轉化能力也所差異。由試驗結果可知，產蛋白酶活性高的菌種在發酵過程中對大豆蛋白的降解能力越強，產β-葡萄糖苷酶活性高的菌種對糖苷類異黃酮水解能力越強。傳統的淡豆豉自然發酵法中的多菌種能夠產生豐富酶系，可促進代謝產物的多級轉化[26-28]。試驗僅以2種酶活性為指標考察單、雙菌發酵的淡豆豉工藝，對于發酵前后大豆蛋白和大豆異黃酮糖苷成分的轉化機制將作為后續研究課題。

4 結論

試驗以枯草芽孢桿菌為發酵菌種，以黑豆為基質制備的淡豆豉，最佳發酵條件為，先經37 ℃發酵7 d，經42 ℃發酵6 d，蛋白酶活性較高，為1 590.24 IU/g，與黃豆基質的差異不顯著。黑豆為基質，以傘枝梨頭霉和米曲霉作為聯合發酵菌，最佳發酵條件為，先經28 ℃發酵7 d，經42 ℃發酵3 d，β-葡萄糖苷酶活性達到47.15 IU/g，優于黃豆基質。發酵菌種、基質和條件不同，對淡豆豉的品質影響較大。多菌種聯合發酵對品質提高具有實際意義。