響應面法優化山楂多糖的閃式提取工藝

李麗，袁建琴，唐中偉，王文斌

山西農業大學生命科學學院（晉中 030801）

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）是薔薇科植物屬落葉喬木，可消食，可促進胃分泌較多的胃消化酶；其提取物能降低血液黏度、提高心肌的供氧和供血能力，增強心臟功能、降低血壓、抗心律失常等[1-8]。多糖一般是由成百上千，通過糖苷鍵連接的單糖形成的，具有較多的生物活性。有關研究表明，一些活性多糖具有增強免疫力、抗氧化、抗腫瘤及調血脂等作用[9]。唐禮可[10]的研究表明山楂中的多糖可以提高動物機體的耐缺氧能力且能提高運動負荷的適應能力。

目前，多糖的提取方法有微波法、離子交換法、超聲輔助法等[11]，閃式提取法利用機械剪切刀對藥物進行切割，并進行攪拌，隨著提取物顆粒的逐漸變小，提取液與藥材顆粒間的化學組分在破碎的過程中分布并且在平衡和不平衡之間快速來回轉換，最終徹底破碎，達到完全平衡[12-14]。同時，利用超速動態分子的滲透作用，使已經剪碎的物質與溶劑分子作用，最終從藥材中分離出來，進入到提取液中，從而實現提取活性成分的目的。閃提技術具有操作簡單，用時少，提取液的用量少，使用起來安全可靠等優點。

通過3個不同的單因素試驗，研究其對多糖提取率的影響，并在響應面的分析軟件中確定出其最優組合，以得到多糖的最高提取率。該試驗為山楂資源的工業化和產業化提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂鮮果實（市售）；葡萄糖標準品、無水乙醇、6%苯酚溶液、濃硫酸；試驗用水為蒸餾水。

1.2 試驗器材

JHBE-50T中草藥閃式提取器（河南智晶生物科技）；SBZ-019中草藥粉碎機（天津泰斯特）；數顯股份干燥箱（上海博訊實業）；標準篩（淄博史克制藥設備制造）；7200-型分光光度計（尤尼柯儀器）；抽濾真空泵（鄭州市亞榮儀器）。

1.3 試驗方法

1.3.1 材料的處理

將新鮮山楂洗凈，去掉核，果肉置于60 ℃烘箱中烘至恒重并用粉碎機粉碎，過篩（孔徑0.18 mm），將粉末放入潔凈干燥的玻璃瓶中，并將其密封，備用。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的建立[15-16]

取1 g干燥至恒重的葡萄糖粉末，定容到1 000 mL的容量瓶中，顛倒搖勻，配制得到1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。從中量取0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mL的溶液于5支干燥潔凈的試管中，并全部補水至1 mL，得到質量濃度為0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/mL的葡萄糖標準溶液，分別依次加入1 mL 6%的苯酚溶液和5 mL的濃硫酸，振蕩，沸水浴15 min，迅速冷卻至室溫，以實驗室使用的蒸餾水作對照，置于540 nm下的分光光度計中測吸光度。

1.3.3 多糖的測定方法[17]

吸取0.2 mL已制備好的多糖溶液于干燥潔凈的試管中，加入0.8 mL的蒸餾水，采用和標準曲線相同的制作方法測定樣品吸光度A，按式（1）計算相應濃度C。

式中：C為稀釋后溶液的質量濃度，mg/mL；m為稱量的山楂粉質量，mg。

1.3.4 液料比[15-16]

稱取4份1 g的干燥山楂粉，放入4個藍蓋瓶中，按液料比30∶1，40∶1，50∶1和60∶1（mL/g）加入蒸餾水，用保鮮膜和橡皮筋封住瓶口，搖勻，在提取電壓為100 V、提取時間為90 s的條件下進行閃式提取，將閃提后的物質置于干燥的大離心杯中，按5 000 r/min離心15 min，取出其上清液進行抽濾，將濾液旋轉蒸發濃縮至3 mL，轉移至15 mL的離心管中，加入4倍體積的無水乙醇進行沉淀，放入4 ℃冰箱，12 h后取出離心管，將管中物質進行抽濾，置于60 ℃烘箱中將抽濾后得到的多糖進行干燥，取出后轉移至50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線，搖勻。后續步驟同1.3.3中多糖的方法進行測定，并重復3次試驗，取其平均值。

1.3.5 提取電壓

稱取4份1 g的干燥山楂粉，放入4個藍蓋瓶中，按液料比40∶1（mL/g）加入蒸餾水，用保鮮膜封住瓶口，搖勻，在提取時間為90 s、電壓分別為90，100，110和120 V的條件下進行閃式提取，后續步驟同1.3.4。

1.3.6 提取時間

稱取4份1 g的干燥山楂粉，放入4個藍蓋瓶中，按液料比40∶1（mL/g）加入蒸餾水，用保鮮膜封住瓶口，搖勻，在提取電壓為110 V，提取時間分別為80，90，100和110 s的條件下進行閃式提取。后續步驟同1.3.4。

1.3.7 響應面設計試驗

為了得到最優的因素組合，在Design-Expert 8.0.6分析軟件中設定液料比（A）、提取電壓（B）和提取時間（C）這3個因素的水平[18]。如表1所示。

表1 響應面分析的因素和水平

2 分析與結果

2.1 葡萄糖標準曲線的建立

如圖1所示，葡萄糖標準曲線為Y=1.366X-0.027 1，R2=0.991 6，表明線性關系良好。

圖1 葡萄糖標準曲線的建立

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 液料比對山楂果肉中多糖提取率的影響

由圖2可知，隨著液料比的增加，溶液濃度減小，山楂果肉中提取到的多糖顯著增加，當液料比為40∶1（mL/g）時，果肉中的多糖得率達到最大值，但隨著液料比例的繼續增加，多糖得率有所減少。由此確定，液料比40∶1（mL/g）是提取多糖的最優條件。

圖2 液料比對得率的影響圖

2.2.2 提取電壓對山楂果肉中多糖提取率的影響

由圖3可知，在100～110 V電壓下，多糖得率有所上升；在110 V時，多糖得率達到最大值；超過110 V后，得率顯著減少。由此確定，提取電壓110 V是多糖提取的最佳電壓。

2.2.3 提取時間對山楂果肉中多糖提取率的影響

由圖4可知，隨著時間延長，多糖得率增多；當時間為90 s時，多糖得率最多；再隨著時間的增加，得率下降。由此確定，時間90 s是提取山楂多糖的最佳時間。

圖3 提取電壓對得率的影響圖

圖4 提取時間對得率的影響圖

2.3 響應面優化試驗

2.3.1 響應面回歸模型的建立與分析

用響應面分析軟件，建立15種組合，并通過試驗得到不同組合下的多糖得率，結果見表2。對回歸模型的方差分析，結果見表3。

由表3中的p值可知，此方程模型是顯著的，失擬項比F值不顯著，方程的F=34.30，p＜0.05，表明二次方程擬合極顯著；A、B、C、BC、A2、B2、C2的p值均小于0.05，呈顯著水平，而AB、AC的p＞0.05，是不顯著的。所以在這個試驗中，各種因素對山楂果肉多糖提取率的影響由大到小依次為提取電壓＞提取時間＞液料比。

表3 回歸模型方差分析

2.3.2 響應面分析結果

由圖5～圖7可知，3種因素間的互作用對多糖的提取均有影響，每個因素均有雙向增加的現象。

圖5 液料比和提取電壓的交互圖

圖6 液料比和提取時間的交互圖

圖7 提取電壓和提取時間的交互圖

由圖7的3D可知，提取電壓-提取時間交互作用的傾斜度最大，曲線較陡，因此山楂果肉中多糖的提取率受提取電壓-提取時間的影響最大；由圖6的3D圖可知，液料比-提取時間交互作用的傾斜率較小，曲線較緩，所以多糖得率受液料比-提取時間的影響次之；由圖5的3D可知，液料比-提取電壓的傾斜度最小，曲線較平滑，所以多糖得率受液料比-提取電壓的交互作用影響最小。

3 結論與討論

選擇合適的液料比、電壓和提取時間可以獲得較高的山楂多糖的提取率，根據響應面分析法建立的各種單因素的最優試驗條件是：液料比42∶1（mL/g），提取電壓105 V，提取時間86 s。在此理論下測得多糖的得率為6.63%，而軟件預測值為6.67%，對比相差0.04%。由此可見，試驗模型選擇合理，具有實用價值。

閃式提取中在以液料比為單因素的試驗中，液料比在達到40∶1（mL/g）后，再隨著液體的增多，得率減少，其原因可能是提取時的液體較多，濃度相對減小，導致刀片與山楂的剪切率下降，使山楂中多糖的有效成分提取不完全；也可能是其他物質的溶出而抑制了多糖的提取[19]；在以提取電壓為單因素的試驗中，當電壓為110 V時，得率達到最大值，之后電壓增大，提取率減少，其原因可能是在高速電機的帶動下，內外刀在高速旋轉的過程中影響了某一部分多糖的內部結構，導致得率減少；在以提取時間為單因素的試驗中，當時間達到90 s時，得率最高，隨著時間的延長，其得率降低，其原因可能是在提取的過程中刀頭不斷剪切，本就可以產生較多熱量，繼而隨著提取時間的延長，溶液溫度升高很快，不穩定的化學成分易發生變化[20-21]。

由此次試驗可知，閃式提取可得到山楂果肉中的多糖，且閃式提取與超聲輔助法提取技術相比，閃提法得率為6.63%，而超聲輔助法得率為1.85%[22]；閃式提取法與微波法相比，微波法的提取率為1.53%，得率比閃提法的得率低，且盡管微波法的時間相對其他方法時間相對要短，但閃式提取只需要90 s，時間比微波法3 min的時間更短[15]。相比之下，閃式提取法速度快，省時，能大大提高提取率，是一種高效提取山楂多糖的方法。