信陽大別山區云芝多糖的純化工藝及其抗氧化活性

葉潤，陳頤輝，蔡靜，李盡哲，孫偉，潘巖

信陽農林學院生物與制藥工程學院（信陽 464000）

云芝（Coriolus versicolor）又名單色云芝、灰芝、彩紋云芝等，為多孔菌科云芝屬植物，硬木質，呈深褐色。云芝具有抗腫瘤、抗肝硬化、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、延緩衰老等作用[1-2]。

云芝多糖為云芝中的主要藥物活性成分之一，對治療肝炎、慢性肝炎、延緩衰老等有極好療效。近年來隨著中藥市場崛起，對云芝多糖的研究逐漸深入，阻礙云芝多糖更深入利用的主要原因是多糖的提取、純化的成本高，收率低，純度不夠[3-4]。已報道的云芝多糖提取的方法有水提醇沉法、超臨界萃取法、纖維素酶解法等[5]，多糖的提取率在10%左右，但是所得多糖純度偏低。目前報道的云芝多糖純化方法有鹽析法、沉淀法、滲析法等，這些方法的成本太高，且純度提升并不明顯[6-8]。

試驗用大孔樹脂法對云芝多糖進行純化，通過對大孔樹脂的靜態-動態吸附進行考察，篩選出最佳純化樹脂及純化條件。試驗方法穩定可行，且大孔樹脂再生簡單，值得大規模推廣。

1 材料與方法

1.1 主要材料

云芝（采于信陽市大別山區雞公山，經信陽農林學院梁麗香副教授鑒定）；大孔樹脂（山東魯抗立科藥物化學有限公司）；葡萄糖對照品（中國生物藥品檢驗所）；1, 1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、ABTS二銨鹽、抗壞血酸（VC）（上海晶抗生物工程有限公司）；無水乙醇、雙氧水、苯酚、水楊酸（上海中石化三井化工有限公司）。

1.2 主要設備

FA2204B電子分析天平（上海精科天美公司）；30 mm×300 mm層析柱（江陰市新輝層析設備有限公司）；RE-201智能升降水浴鍋（南京科爾儀器設備有限公司）；RE-85Z旋轉蒸發儀（鞏義市英峪予華儀器）；UV-2600紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 云芝多糖的粗提

將云芝干燥并粉碎至粒徑0.425 mm，置于燒杯中，用5倍量的水在60 ℃水浴中浸泡12 h，過濾，將濾液濃縮后加入95%乙醇，靜置1 h，待沉淀完畢后過濾，重復3次，干燥，得粗多糖樣品，純度為46.81%，備用[9]。

1.3.1.1 大孔樹脂的處理

取10種不同型號的大孔樹脂，先用蒸餾水洗滌，接著用4倍柱體積的95%乙醇浸泡24 h后，用蒸餾水洗滌至無乙醇味，將處理好的大孔樹脂分別用4倍柱體積5% NaOH和HCl溶液浸泡3 h，用蒸餾水洗滌至中性[10]。

1.3.1.2 靜態吸附考察

將1.3.1中的樣品配置成質量濃度5.0 mg/mL溶液，取10種不同型號的大孔樹脂各1 g，放入250 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL樣品溶液，將錐形瓶置于30 ℃恒溫搖床上振蕩24 h，取上清液，UV法測定多糖濃度，按式（1）和（2）計算大孔樹脂的吸附量及吸附率。

將吸附后的大孔樹脂過濾，蒸餾水洗滌后，加入100 mL體積分數85%的乙醇溶液，在同樣條件下進行解吸，取解吸液用UV法測定多糖的濃度，按式（3）計算解吸率。

式中：c0為樣品溶液中多糖的原始質量濃度，mg/mL；c1為大孔樹脂吸附后溶液中多糖質量濃度，mg/mL；c2為解吸液中多糖質量濃度，mg/mL；V為樣品溶液體積，mL；m為干燥的大孔樹脂質量，g。

1.3.2 靜態吸附的動力學曲線

將1.3.1中的樣品配置成質量濃度5.0 mg/mL溶液，取AB-8型大孔樹脂1 g，放入250 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL樣品溶液，將錐形瓶置于30 ℃恒溫搖床上振蕩吸附6 h，每隔0.5 h取1 mL溶液，測定吸光度，計算吸附率，繪制吸附曲線[11]。

1.3.3 動態吸附-吸附效果的影響因素考察

確定最佳純化樹脂為AB-8型大孔樹脂，將1.3.1中的樣品配制成質量濃度5.0 mg/mL溶液，取20 mL，用稀鹽酸分別調節pH 1.0，2.0，3.0，4.0和5.0，以2.0 BV/h（1 BV=50 mL）的速度上樣并靜置2 h，保持柱溫在30 ℃，收集流出液，測定吸光度，計算大孔樹脂的吸附率。再固定其他因素，分別考察上樣質量濃度3.0，4.0，5.0，6.0和7.0 mg/mL，上樣速率1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 BV/h對大孔樹脂吸附效果的影響。

1.3.4 動態吸附-解吸效果的影響因素考察

將1.3.1中的樣品配制成質量濃度5.0 mg/mL溶液，取20 mL，按照1.3.3確定的最佳條件上樣，分別用3.0 BV 0（蒸餾水），10%，30%，50%，70%和90%的乙醇溶液洗脫，洗脫速率2.0 BV/h，收集洗脫液，測定吸光度，計算大孔樹脂的解吸率。固定其他因素，分別考察洗脫劑用量1.0，2.0，3.0和4.0 BV，洗脫流速1.0，2.0，3.0和4.0 BV/h對大孔樹脂解吸效果的影響。

1.3.5 驗證試驗

按照確定的最優條件，選AB-8型號大孔樹脂，將1.3.1中的粗糖配制成質量濃度5.0 mg/mL溶液，取20 mL，調節pH 4.0，以2.0 BV/h速度上樣并靜置2 h，保持柱溫在30 ℃，用70%乙醇溶液洗脫，洗脫劑用量分別在3.0 BV，洗脫速度在1.0 BV/h，收集洗脫液，測定吸光度，計算多糖含量。

1.3.6 含量測定

選葡萄糖為對照品，用苯酚-硫酸法測量多糖含量[12]。按式（4）計算多糖含量。

式中：W為多糖含量，%；c為洗脫液中多糖質量濃度，mg/mL；V’為洗脫液體積，mL；m為洗脫液干燥后樣品總質量，g。

1.3.7 抗氧化活性測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力

用無水乙醇在100 mL容量瓶中配制濃度為0.5 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，放冰箱中保存待用。將純化后的多糖溶液用乙醇分別稀釋到0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6 mg/mL，取1.0 mL的DPPH-乙醇溶液，分別向其中加入1.0 mL不同質量濃度的多糖溶液，室溫下靜置30 min，在517 nm波長處測定吸光度（A樣品）。用乙醇代替DPPH作為對照組測定吸光度（A對照）。用蒸餾水代替多糖溶液作空白組，測定吸光度（A空白）。用相同濃度的維生素C溶液按照上述方法進行測定，作為陽性對照[13]。

1.3.7.2 ABTS自由基清除能力

制備ABTS自由基工作液：將等體積濃度7.5 mmol/L的ABTS二銨鹽溶液和2.5 mmol/L的K2S2O8混合過硫酸鉀溶液混合，避光保存，反應15 h，即生成ABTS陽離子自由基，使用前，用無水乙醇將自由基儲備液進行稀釋，使其在734 nm波長下的吸光度為0.7±0.1。取2 mL該溶液，向其中分別加入0.5 mL質量濃度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6 mg/mL的多糖溶液，避光條件下反應10 min，在734 nm波長測定吸光度（A樣品）。用蒸餾水代替ABTS自由基工作液作為對照組測定吸光度（A對照）。用蒸餾水代替多糖溶液作空白組，測定吸光度（A空白）。用相同濃度VC溶液按照上述方法進行測定，作為陽性對照[14]。

1.3.7.3 羥自由基清除能力

采用Fenton體系法，分別取2.0 mL質量濃度1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0和8.0 mg/mL多糖溶液，向其中加入1.0 mL濃度5.0 mmol/L水楊酸溶液和1.0 mL濃度5.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液，搖勻后，加入1 mL濃度為5.0 mmol的H2O2和2 mL蒸餾水，置于30 ℃水浴鍋中反應0.5 h，在510 nm處測定吸光度（A樣品）。用蒸餾水代H2O2測定吸光度為（A對照）。用蒸餾水代替多糖溶液測定吸光度為（A空白）。用相同濃度的VC溶液按照上述方法進行測定，作為陽性對照[15]。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

10種大孔樹脂的吸附效果見表1，其中AB-8、DM18、D140型號大孔樹脂對云芝多糖的吸附率最高，但是DM18、D140型號大孔樹脂的解析率偏低，這應該與這2種大孔樹脂的比表面積大有關系。從大孔樹脂的吸附率及解析率2方面綜合考慮，最終確定AB-8型號大孔樹脂，為最佳純化樹脂。

表1 10種大孔樹脂的靜態吸附效果

2.2 靜態吸附的動力學曲線

結果如圖1所示，吸附時間2.0 h前，AB-8型大孔樹脂對云芝多糖的吸附呈遞增趨勢，吸附時間2.0 h后，吸附量趨于穩定，吸附基本達到飽和。

圖1 靜態吸附的動力學曲線

2.3 動態吸附-吸附效果的影響因素考察

結果如圖2所示，在pH 4.0之前，吸附率隨著pH增大而增大，之后降低。在pH 4.0時，AB-8型號大孔樹脂對云芝多糖的吸附率達到最大值，這應該與大孔樹脂內吸附的離子有關系。

上樣質量濃度大于5.0 mg/mL，AB-8型大孔樹脂對云芝多糖的吸附率開始明顯降低，表明此時大孔樹脂已經達到吸附飽和，再加大上樣濃度，云芝多糖將不能被吸附。

上樣速率小于2.0 BV/h，處于柱子下面大孔樹脂無法接觸到多糖溶液；上樣速率大于2.0 BV/h，柱子中的大孔樹脂與多糖溶液接觸的時間不夠，都會導致吸附率降低。

因此，最佳上樣條件為：pH 4.0，上樣濃度5.0 mg/mL，上樣速率2.0 BV/h。

圖2 各因素對吸附效果的影響

2.4 動態吸附-解吸效果的影響因素考察

結果如圖3所示，乙醇體積分數50%時，AB-8型大孔樹脂對云芝多糖的解吸率最高，這與多糖的極性有直接的關系。

隨著洗脫劑用量加大，多糖逐漸被解吸，解吸率逐漸增大，洗脫劑用量3.0 BV時，解吸率達到最大值，即使繼續用洗脫劑洗脫，多糖也不能被洗脫。

洗脫速率2.0 BV/h時，云芝多糖的解吸率最高。這是因為洗脫速率太小會導致多糖在樹脂柱中停留時間太長，不利于洗脫；洗脫速率太大會導致洗脫劑來不及與多糖充分接觸。

因此，最佳解吸條件為：乙醇體積分數50%、洗脫劑用量3.0 BV、洗脫速率2.0 BV/h。

2.5 驗證結果

采用確定的最佳條件，選用AB-8型號大孔樹脂進行上樣、洗脫等純化操作，云芝多糖的純度從46.81%提高到81.24%。

2.6 體外抗氧化性

結果如圖4，DPPH自由基清除率與云芝多糖濃度純在數量關系，隨著質量濃度增大而增大，云芝多糖質量濃度0.8 mg/mL時，對DPPH自由基的清除能力達到96.17%，之后達到平緩，IC50=0.388 mg/mL，表現出很強清除能力。

隨著云芝多糖質量濃度增加，對ABTS自由基清除能力也逐漸增加，云芝多糖質量濃度0.6 mg/mL時，最大清除能力達到85.35%，IC50=0.419 mg/mL，同濃度下清除能力略小于VC，表現出很強清除能力。

隨著云芝多糖質量濃度增加，對羥自由基的清除能力也逐漸增加，云芝多糖質量濃度7.0 mg/mL時，達到最大清除率為80.32%，IC50=4.423 mg/mL，同濃度下清除能力雖小于VC，但仍表現出很強的清除能力。

圖3 各因素對解吸效果的影響

圖4 抗氧化性結果

3 結論

以信陽市大別山區云芝為原材料，通過水提醇沉法對多糖進行提取，借助大孔樹脂進行純化，確定AB-8型號大孔樹脂為云芝多糖的最佳純化樹脂，最佳上樣條件為：pH 4.0，上樣質量濃度5.0 mg/mL，上樣速率2.0 BV/h。最佳洗脫條件為：乙醇體積分數50%，洗脫劑用量3.0 BV，洗脫速率2.0 BV/h。通過AB-8大孔樹脂的純化，云芝多糖純度由46.81%提高到81.24%。對DPPH、ABTS、羥自由基都有較好的清除作用，且隨著多糖質量濃度增大而增強。工藝穩定可行，且大孔樹脂的再生能力強，可為信陽市大別山區云芝資源的開發利用提供科學依據。