西洋參超微粉制備工藝及藥效評價

趙文英，郝豪奇，肖薇，朱慶書

1. 青島科技大學化工學院（青島 266042）；2. 青島科技大學高密校區（濰坊 261500）

西洋參為五加科植物西洋參（Panax quinquefoliumL.）的干燥根，研究發現西洋參含有皂苷、脂肪酸、多糖、氨基酸、甾醇、黃酮、揮發油及人體必需微量元素[1]等多種活性成分。傳統醫學認為其具有補氣養陰，清熱生津的功效；現代藥理試驗證明，西洋參有耐缺氧、抗疲勞、免疫增強、抗氧化、抗腫瘤等作用，因此西洋參為臨床上常用的滋補類中藥。為減少藥效成分損失，臨床上通常是將西洋參粉碎成細粉后直接入藥。但采用傳統粉碎技術制備的西洋參細粉，粒徑通常在80～100目之間（即150 μm左右），服用時藥效成分溶出不完全，藥材利用率并沒有明顯提升。

超微粉碎技術是在粉體學的基礎上，利用機械或流體力學方法，將固體物料粉碎至微米級甚至納米級微粉的技術[2]。與傳統粉碎技術相比，超微粉產品具有更大的表面積和孔隙率，很好的溶解性，很強的吸附性、流動性，以及化學反應速度快等一系列特殊的物理化學性質。國內外已廣泛應用于陶瓷、食品、醫藥、紡織、化妝品及航空航天等領域[3]。

超微粉碎技術應用于中藥產業最早集中于雄黃、石膏等礦物藥，以增加它們的溶解率，提高療效[4]。近年來，基于破壞植物細胞壁，促進植物細胞內成分溶解、擴散等原理的超微粉技術在植物類中藥加工中的應用研究日趨增多，如鞠愛華等[5]研究梔子超微粉與普通粉的指紋圖譜，發現超微粉碎不改變化學成分的類型，但主要化學成分含量會增加，卻未對成分活性進行深入探討。Choi等[6]研究超微粉碎對當歸藥效的影響，發現超微粉碎可提高其加工、儲存及服用過程中穩定性，而未對其機理進行深入探討。Zhi等[7]對比大鼠口服丹參超微粉與飲片提取物后體內成分變化，發現超微粉可提高有效成分吸收率與利用度；而Wang等[8]對丹參超微粉治療心肌梗塞作用研究，發現相同劑量下超微粉療效比傳統丹參提取物的作用更顯著，也從另一個側面反映出超微粉碎能提高有效成分的生物利用度。這些研究從不同角度證實，超微粉碎技術應用于中藥加工具有顯著的改善中藥材生物利用度，增強藥效的作用。近幾年，超微粉碎技術應用于西洋參等貴細藥材的加工，并開展相關研究。Chen[9]與徐浩淇等[10]研究粉體粒徑對西洋參中皂苷成分溶出度的影響，通過體外溶出度研究證明，西洋參破壁飲片化后能夠改善其有效成分的溶出效率，但對其藥效的影響沒有進行研究。侯集瑞等[11]對不同粒徑西洋參的藥效進行初步比較研究，發現其微米級超微粉的藥效隨著粒徑的減少而有所增強，但藥效增強作用與其有效成分釋放量變化是否相關沒有進行深入探究。試驗通過對比西洋參超微粉和普通粉在藥效方面的變化，并進一步進行透皮研究，從藥動學角度初步探究西洋參超微粉藥效增強作用機制，為西洋參等名貴中藥材加工提供依據和方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

剪切式粉碎機（鄭州攀奇機械設備有限公司）；行星式球磨機（長沙天創粉末技術有限公司）；粒徑分析儀（德國新帕泰克有限公司）；超聲清洗儀（江寧萬和超聲電子設備有限公司）；紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；透皮吸收儀（配Franz擴散池，上海玉研科學儀器有限公司）；721分光光度計（河北潤聯科技開發有限公司）。

羧甲基纖維素鈉（AR，天津市大茂化學試劑廠）；甘油、香草醛、高氯酸、冰醋酸（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；西洋參（青島古城中藥房）；心得安（青島國風藥業股份有限公司）；小鼠（高校醫用實驗動物中心）；豬腸衣（市售）。

1.2 西洋參超微粉制備工藝考察

1.2.1 西洋參超微粉制備工藝影響因素考察

取預先加工干燥后的西洋參普通粉（過120目標準篩），在行星球磨機中進行超微粉碎。以粒徑為指標，分別考察球料質量比（20∶1，30∶1，40∶1，50∶1和60∶1）、大小球數比（5∶15，5∶20，5∶25，5∶30和5∶35）、轉速（150，200，250，300和350 r/min）、時間（5，10，15，20和25 min）4個因素對西洋參粉末粒徑影響。

1.2.2 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，綜合考慮各因素對超微粉粒徑的影響，以球料質量比、大小球數比、轉速、時間比為主要影響因素，按L9(34)因素水平采用正交設計[12]考察制備西洋參超微粉制備的最佳工藝。因素水平表見表1。

表1 因素水平表

1.3 西洋參超微粉體外抗氧化作用考察

1.3.1 DPPH·清除試驗

參考文獻[13]方法，取西洋參超微粉，以甲醇為溶劑提取，離心后得到上清液，普通粉同法提取作為對照。取1.25 mL上清液加入2 mL 1×10-4mol/L DPPH溶液，避光反應30 min，于517 nm處測定吸光度Ai。甲醇代替上清液吸光度為A0，甲醇代替DPPH測得吸光度Aj。

式中：A0為未加樣品溶液時DPPH溶液的吸光度；Ai為加入樣品溶液時DPPH溶液的吸光度；Aj為未加DPPH溶液時樣品溶液的吸光度。

1.3.2 ·OH清除試驗

參考文獻[14]方法依次向10 mL試管中依次加入樣品溶液，新制的9 mmol/L FeSO4溶液，6 mmol/L H2O2溶液各1 mL，搖勻，靜置10 min后加入9 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL，搖勻，37 ℃水浴30 min，以70%乙醇為參比溶液，于517 nm處測定吸光度Ai，用水代替水楊酸測定吸光度Aj，用甲醇代替樣品溶液測定吸光度A0，同條件下平行操作3次。

式中：A0為未加樣品溶液的吸光度；Ai為加入樣品溶液的吸光度；Aj為加入水楊酸溶液的吸光度。

1.4 西洋參超微粉體內藥效評價

1.4.1 小鼠耐缺氧試驗研究

取昆明種小鼠80只，隨機分為8組，分為心得安陽性對照組（0.25 mg/mL），空白對照組（生理鹽水），超微粉和普通粉的低（0.025 g/mL）、中（0.05 g/mL）、高濃度（0.075 g/mL）組[15]。灌胃給藥，30 min后將小鼠放入盛有15 g鈉石灰的250 mL廣口瓶中，蓋嚴，使之不漏氣，開始計時，觀察并記錄小鼠因缺氧而窒息死亡的時間[16]。

1.4.2 小鼠抗疲勞及免疫增強試驗研究

取昆明種小鼠80只，隨機分為8組，分組及給藥劑量同1.4.1。每組小鼠單獨喂養，連續灌胃給藥1周，保證足夠的水和食物。每天抓摸動物5～10 min，使動物適應試驗過程中的抓摸觸碰。試驗前觀察小鼠各方面活動，待小鼠活動趨于平穩后開始試驗。將各組小鼠分別放入游泳箱中，尾部負5%重物，保證游泳箱中水深不低于30 cm，水溫維持室溫約20 ℃。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間[17]。結束一組小鼠試驗后換水，以消除前組小鼠氣味對后組小鼠的行為的影響。在小鼠死亡后肢體未僵硬之前將小鼠解剖，記錄每只小鼠體重及脾重[18]。

1.5 西洋參超微粉體外透皮吸收研究

參照文獻[19]，以齊墩果酸為標準品，按照常規方法制備標準曲線，在0.2～1.8 mg/mL范圍內標準曲線y=3.180 1x+0.057 9（r=0.999 6）。

參照文獻[20]方法，取市售豬腸衣，洗凈，剪成合適大小，固定于Franz擴散池中間，使內側朝向接收池，將Franz擴散池編號1～2，供給池加入用羧甲基纖維素鈉、甘油及普通粉或超微粉制成凝膠，接收池中加入生理鹽水至刻線，37±0.5 ℃恒溫水浴，300 r/min恒速磁力攪拌。開始計時后，于12 h內分段取樣。樣品置于試管中，于560 nm波長處測定吸光度，由標準曲線計算累計釋放量。以累計濃度為縱坐標，時間為橫坐標，繪制曲線。

1.6 統計學分析

數據用Excel建立數據庫，采用SPSS 21.0統計軟件進行處理，按LSD檢驗法進行多重比較，p＜0.05為差異有統計學顯著意義。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果分析

如圖1（a）所示，球料質量比為40∶1時物料粒徑最小。這是因為球料質量比太大時，研磨介質間以及介質和襯板間沖擊摩擦損失的無用功增加[21]，金屬消耗增加，使研磨效率降低；球料質量比太小時，物料的緩沖作用增加，研磨效果也會減弱，因此選定40∶1為最佳球料質量比；由圖1（b）可知，隨著球磨機大小球比增大，粉體的粒徑呈現先減小后增大趨勢，這是因為在球磨物料時，大球能量高對大顆粒物料作用強，小球填充于大球空隙間，對于粗細不同的物料產生作用，如果大球數過多，物料大顆粒易被粉碎，但缺乏進一步的研細，物料平均粒徑會較大；小球數過多，會阻礙大球對物料的沖擊粉碎，同時球與物料的總質量超出球磨罐有效負荷，球與物料有效接觸機會下降，粉碎效果也會變差，因此選定5∶20為最佳配比；從圖1（c）可知，隨著行星式球磨機轉速增加，西洋參粉體粒徑逐漸變小，是因為西洋參與粉碎介質接觸增加，藥材不斷被機器研磨的力度增大，考慮到設備機身承受能力，并且在400 r/min時粒徑減少不明顯，因此選定300 r/min作為最佳轉速；圖1（d）顯示粉碎時間對粒徑的影響呈現先快速降低，隨后緩慢增加趨勢，隨著粉碎時間[22]延長，小粒徑的西洋參粉體增多，粉碎難度增大，因此粉碎細度增加緩慢，同時由于設備工作散熱，西洋參細粉含多糖較多，自身黏度較高，使粉體出現團聚現象，粒徑反而會有所增大，因此粉碎時間在15 min最佳。

2.2 西洋參超微粉制備工藝優化

根據表1因素水平設定條件進行試驗，利用粒徑分析儀測得西洋參納米顆粒的粒徑的大小，結果見表2。極差的大小順序為C（轉速）＞A（球料質量比）＞B（大、小球數比）＞D（時間），轉速與球料比為粒徑主要影響因素，大小球的比例與時間為次要因素。

通過極差分析所得最佳組合為A3B3C1D2，為進一步驗證正交試驗結果，進行3次平行試驗，粉體平均粒徑483.2 nm，小于正交表中最小粒徑530.7 nm；因此，制備西洋參超微粉最佳條件為球料質量比50∶1，大小球數比5∶20，轉速250 r/min，轉動時間15 min。超微粉粒徑分布如圖2所示，粒徑分布范圍在400～780 nm之間，屬于納米級超微粉范圍。

圖1 超微粉碎單因素結果

表2 正交法優化西洋參超微粉制備工藝結果

圖2 西洋參超微粉最佳工藝粒徑分布

2.3 體外抗氧化試驗

DPPH·清除試驗與·OH清除試驗結果表明（見表3），體外西洋參超微粉抗氧化活性略低于普通粉。楊麗等[23]在進行葡萄籽超微粉抗氧化活性研究發現，隨著超微粉粒徑減少，DPPH·和·OH清除能力均呈現下降趨勢，該研究與本試驗結果相似。這可能是由于機械粉碎過程中產生了能量積聚，破壞藥材中對熱比較敏感的抗氧化活性成分，使其抗氧化能力降低。另外，超微粉中有效成分缺乏細胞壁的保護，更易受外界環境中的光、熱等因素的影響，因此加工過的超微粉如果沒有及時處理或保管不當，其抗氧化活性也容易降低。

表3 超微粉DPPH·與·OH清除率

2.4 體內藥效學結果分析

2.4.1 西洋參超微粉耐缺氧作用

由圖3所示，西洋參超微粉組及普通粉組的耐缺氧時間均比生理鹽水組的長，并且同一粒徑下中劑量組相較于高、低劑量組的提高耐缺氧作用更明顯；各濃度下超微粉組小鼠的存活時間整體長于普通粉組，說明西洋參的提升耐缺氧能力受給藥濃度和藥粉粒徑影響。但按LSD檢驗法進行多重比較，只有超微粉中濃度組相比于空白對照有明顯的增強耐缺氧能力，并且超微粉中濃度組與心得安組存在顯著性差異，說明西洋參經超微粉碎加工后可顯著增強小鼠耐缺氧能力，但增強作用弱于臨床常用藥心得安。

2.4.2 西洋參超微粉抗疲勞及免疫增強作用

由圖4可知，西洋參普通粉組與超微粉組小鼠的游泳時間均長于生理鹽水，并且低劑量組延長作用更明顯；各濃度下超微粉組小鼠的游泳時間均長于普通粉組。說明西洋參的抗疲勞作用受給藥濃度和藥粉粒徑影響。按LSD檢驗法進行多重比較，普通粉低劑量組和超微粉中低劑量組相較于空白對照組提升抗疲勞能力均具有差異顯著性，尤其是超微粉低劑量組相較于陽性對照組（心得安組）和普通粉低劑量組具有更顯著地提升抗疲勞能力，說明超微粉碎可顯著增強西洋參的生物活性。

如圖5所示，西洋參普通粉組與超微粉組小鼠的脾重指數均大于生理鹽水，并且中劑量給藥組作用更明顯，說明西洋參具有免疫增強作用，且有濃度相關性。按LSD檢驗法進行多重比較，心得安組、普通粉中濃度組、超微粉中低濃度組與生理鹽水組的免疫增強作用存在差異顯著性；超微粉組小鼠的脾重指數整體大于普通粉組，說明超微粉碎具有增強藥效的作用，但增強作用差異沒有顯著性。

圖3 藥物對耐缺氧能力的影響

圖4 藥物對游泳時間的影響

圖5 西洋參超微粉碎后對脾重指數的影響

2.5 西洋參超微粉體外透皮吸收結果

從圖6曲線可以看出，西洋參中皂苷類成分透過量隨著時間延長呈現均勻增長，且超微粉透過量始終高于普通粉。目前普遍認為[24]，中藥材經超微粉碎后使細胞破壁率提高，有效成分溶出度增加[25]，同時因為粒徑顯著減小，比表面積增加，藥粉更易吸附于胃腸壁，也有助于藥效成分經生物膜的跨膜轉運。因此超微粉碎技術可通過增加中藥材中有效成分在胃腸道的吸收而提高藥效。

圖6 西洋參超微粉碎后對體外透皮吸收的影響

3 結論

對西洋參超微粉的制備工藝進行優化，并在此基礎上對其體外抗氧化和體內耐缺氧、抗疲勞、免疫增強作用進行比較研究。試驗結果表明，西洋參經超微粉碎后，體外抗氧化能力略有下降，而體內各項藥效學評價指標均有所增強。體外透皮吸收試驗顯示超微粉碎技術主要是增強藥材中有效成分溶出度及在胃腸道的吸收而增強療效。