食用動(dòng)植物油脂中苯并(a)芘含量的快速測(cè)定

劉孝英，王毅

1. 四川文理學(xué)院康養(yǎng)產(chǎn)業(yè)學(xué)院（達(dá)州 635000）；2. 達(dá)州市食品藥品檢驗(yàn)所（達(dá)州 635000）

苯并(a)芘（BaP），化學(xué)式為C20H12，是一種五苯環(huán)芳香烴類化合物，常溫下為無(wú)色至淡黃色針狀晶體（純品），性質(zhì)穩(wěn)定，沸點(diǎn)475 ℃，熔點(diǎn)179 ℃，不溶于水，微溶于乙醇、甲醇，溶于苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有機(jī)溶劑中[1-4]。研究表明，BaP是強(qiáng)致癌物，微小劑量就能引起癌變，對(duì)人體細(xì)胞具有強(qiáng)烈致突變和致畸性[5-8]，世界多數(shù)國(guó)家加強(qiáng)對(duì)食品中BaP限量管理，相繼出臺(tái)許多關(guān)于BaP的強(qiáng)制性最低限量值標(biāo)準(zhǔn)，GB 2762—2017[9]規(guī)定油脂及其制品中BaP限值為10 μg/kg，歐盟限值為2 μg/kg[10]。苯并(a)芘在環(huán)境中存在廣泛，來(lái)源主要有2個(gè)方面：一是工業(yè)生產(chǎn)和生活過(guò)程中煤炭、石油和天然氣等燃料不完全燃燒產(chǎn)生的廢氣，包括汽車尾氣、橡膠、瀝青生產(chǎn)及吸煙產(chǎn)生的煙氣等，它通過(guò)食物鏈在動(dòng)植物體內(nèi)中發(fā)生生物蓄積，造成食物污染[11-12]；二是食物在熏制、烘烤和煎炸過(guò)程中，脂肪、膽固醇、蛋白質(zhì)和碳水化合物等在高溫條件下會(huì)發(fā)生熱裂解反應(yīng)，經(jīng)過(guò)環(huán)化和聚合反應(yīng)就能夠形成包括苯并(a)芘在內(nèi)的多環(huán)芳烴類物質(zhì)，尤其是當(dāng)食品在煙熏和烘烤過(guò)程中發(fā)生焦糊現(xiàn)象時(shí)，苯并(a)芘的生成量將會(huì)比普通食物增加10～20倍[13-14]。油料高溫蒸炒、油脂提取壓榨、貯存運(yùn)輸均易產(chǎn)生或污染苯并(a)芘[15-16]。中國(guó)2018年食用植物油消費(fèi)量為3 767萬(wàn) t，占全球食用植物油消費(fèi)量的18.8%，居世界第一。因此，建立精準(zhǔn)有效的油脂中苯并(a)芘檢測(cè)方法，對(duì)提高油脂質(zhì)量，保護(hù)人類身體健康有著重要意義。通過(guò)比較分析，采用全自動(dòng)固相萃取凈化，避免手動(dòng)加樣萃取，接觸有機(jī)試劑較少，對(duì)試驗(yàn)人員有較好保護(hù)，易于批處理，試驗(yàn)耗時(shí)較短，人為操作誤差較小，適用于動(dòng)植物油脂中苯并(a)芘含量的批量快速測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；GX274全自動(dòng)固相萃取儀（吉而遜實(shí)驗(yàn)儀器（上海）有限公司）；12位固相萃取裝置（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；Milli-Q超純水機(jī)（默克投資（中國(guó)）有限公司）；BS210S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；Reeko Auto EVA-20 Plus全自動(dòng)氮吹濃縮儀（深圳市銳科信息技術(shù)有限公司）。

苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品（GBW（E）080476中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；食用植物油、牛油、豬油（當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)銷售）；正己烷、二氯甲烷、乙腈（色譜純）；苯并(a)芘分子印跡小柱（MIP-BAP，500 mg，6 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；中性氧化鋁小柱（Alumina-N，500 mg，6 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取

準(zhǔn)確稱取0.5 g試樣于10 mL玻璃管中，加入5 mL正己烷，超聲混合0.5 min，若不易溶，可50 ℃水浴加熱溶解，待凈化。

1.2.2 固相萃取

1.2.2.1 手動(dòng)

將苯并(a)芘凈化小柱置于12位固相萃取裝置上，手動(dòng)吸取試劑（二氯甲烷+正己烷）活化小柱、轉(zhuǎn)移樣液、淋洗除雜（正己烷）、收集凈化液（二氯甲烷），將凈化液在40 ℃下氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確吸取1 mL乙腈超聲復(fù)溶0.5 min，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

1.2.2.2 自動(dòng)

將待凈化液和苯并(a)芘凈化小柱置于全自動(dòng)固相萃取儀上，按設(shè)定程序，活化小柱（5 mL二氯甲烷+5 mL正己烷）、轉(zhuǎn)移樣液、淋洗除雜（5 mL正己烷）、收集凈化液（5 mL二氯甲烷），將凈化液在40℃下氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確吸取1 mL乙腈超聲復(fù)溶0.5 min，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

1.2.3 色譜條件

色譜柱，CNW Athena PAHs（250 mm×4.6 mm，5 μ m）；流動(dòng)相，乙腈-水（90∶10）；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)384 nm，發(fā)射波長(zhǎng)406 nm。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確吸取1.00 mL苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.52 μg/mL），用乙腈定容至25 mL容量瓶，得到標(biāo)準(zhǔn)中間液（180.8 ng/mL），用乙腈稀釋得到4.52，9.04，18.08，36.16，45.2和72.32 ng/mL的校準(zhǔn)曲線溶液，臨用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱的選擇

GB 5009.27—2016[17]中采用中性氧化鋁小柱和分子印跡小柱，比較分析二者在測(cè)定食用油脂中苯并(a)芘含量上的區(qū)別，結(jié)果表明，同等條件下，使用中性氧化鋁小柱凈化樣品的回收率低于使用分子印跡小柱凈化樣品的回收率，且RSD較高，所以分子印跡小柱具有更好的正確度和穩(wěn)定性。

表1 2種萃取柱比較（n=7）

2.2 淋洗和洗脫溶劑的選擇

參考有關(guān)研究[18]，選擇正己烷為淋洗劑，5 mL正己烷基本能將固相萃取柱上油脂完全淋洗下來(lái)，比較分析乙腈和二氯甲烷對(duì)目標(biāo)物質(zhì)苯并(a)芘的洗脫效果，二者差異不顯著，但是乙腈與正己烷不互溶，洗脫時(shí)需要加壓操作，且乙腈耗量較大，后續(xù)氮吹濃縮耗時(shí)較長(zhǎng)，穩(wěn)定性也較差，所以選擇二氯甲烷進(jìn)行洗脫。二氯甲烷4 mL以上能夠?qū)⒛繕?biāo)物質(zhì)苯并(a)芘完全洗脫，考慮穩(wěn)定性，選擇5 mL二氯甲烷進(jìn)行洗脫。

2.3 萃取方式比較

使用分子印跡小柱，采用兩種萃取方式進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平行測(cè)定7次，回收率、RSD、溶劑耗量、耗時(shí)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 2種萃取方式比較（n=7）

與手動(dòng)萃取方式相比，自動(dòng)萃取方式回收率較高，RSD較低，具有更好的正確度和穩(wěn)定性，且手動(dòng)萃取方式操作人員必須時(shí)刻觀察萃取流速，避免小柱干燥，費(fèi)時(shí)費(fèi)工，尤其是批量處理樣品時(shí)容易出現(xiàn)加液差錯(cuò)，而自動(dòng)萃取方式按照設(shè)定程序進(jìn)行，流速可控，時(shí)間一致，有機(jī)試劑耗量更低，試驗(yàn)耗時(shí)更短，人為操作誤差較小，接觸有機(jī)試劑少，既有利于保護(hù)試驗(yàn)操作人員健康，又有利于大批量樣品快速檢測(cè)。

2.4 線性及校準(zhǔn)

吸取苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，高效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)，校準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=92 735.5x+28 854，R2=0.999 8，苯并(a)芘在4.52～72.32 ng/mL之間線性關(guān)系良好。

圖1 校準(zhǔn)曲線

2.5 檢出限和定量限

根據(jù)GB/T 32465—2015[19]和GB/T 27417—2017[20]，檢出限的計(jì)算和表達(dá)方法較多，試驗(yàn)采用信噪比法結(jié)合逐步稀釋法，將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋至S/N=3時(shí)的濃度即為檢出限濃度，S/N=10時(shí)為定量限，經(jīng)過(guò)稀釋測(cè)定，0.090 4 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的S/N值見(jiàn)表3。

從表3可以計(jì)算出當(dāng)S/N=3時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度約為0.065 ng/mL。

檢出限=檢出限濃度×定容體積/取樣量=0.065（ng/mL）×1.00（mL）/0.5（g）=0.13 μg/kg （1）

定量限=0.13×10/3=0.43 μg/kg （2）

檢出限低于GB 5009.27—2016中規(guī)定的檢出限0.2 μ g/kg和定量限0.5 μg/kg。

表3 0.090 4 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的S/N值（n=7）

2.6 回收率和精密度

采用空白食用油樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，添加3個(gè)不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，相當(dāng)于樣品含量9.04，18.08和36.16 μg/kg，在1.2的自動(dòng)萃取條件下測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)濃度樣品平行測(cè)定7次，結(jié)果顯示，3個(gè)不同加標(biāo)梯度下的平均回收率分別為97.1%，98.3%和99.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.1%，1.4%和1.5%，方法的正確度和精密度滿足化學(xué)分析要求。

2.7 市售樣品測(cè)定

采集當(dāng)?shù)厥惺鄣?0個(gè)食用動(dòng)植物油脂樣品，包括調(diào)和油、大豆油、花生油、菜籽油、玉米胚芽油、葵花籽油、橄欖油、芝麻油、花椒油、牛油、豬油等樣品，按1.2的自動(dòng)萃取方法制備樣品溶液，液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)，計(jì)算含量，其中6批樣品未檢出苯并(a)芘，42批樣品檢出苯并(a)芘但含量低于3.0 μ g/kg，2批樣品檢出含量超過(guò)10 μ g/kg（分別為11.3和14.6 μg/kg）。苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液及實(shí)際樣品的色譜圖見(jiàn)圖3，苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰時(shí)間在7.7 min左右。

表4 樣品的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=7）

圖2 加標(biāo)回收樣品色譜圖

圖3 苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）及實(shí)際樣品（B）的色譜圖

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)比較分析，采用正己烷提取，分子印跡小柱-全自動(dòng)固相萃取凈化，高效液相色譜-熒光檢測(cè)器測(cè)定食用動(dòng)植物油脂中苯并(a)芘含量，結(jié)果表明，方法回收率高，穩(wěn)定性好，批處理快，接觸有機(jī)試劑少，適用于食用動(dòng)植物油脂中苯并(a)芘含量的快速測(cè)定。