Ba2+對南美白對蝦酚氧化酶活性和結構的影響

佟抒洋，張書琪，郭雨晴，張俊健，張弛，呂艷芳

渤海大學食品科學與工程學院（錦州 121013）

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）廣泛存在于生物界，節肢動物體中一般稱為酚氧化酶，植物中一般稱為多酚氧化酶，脊椎動物、微生物和軟體動物中一般稱為酪氨酸酶。在生物體內，多酚氧化酶是黑色素合成的關鍵酶[1]，水果、蔬菜、對蝦等食品的褐變均與其活性有關，它是一種結構復雜的含銅金屬氧化酶。那么，金屬離子對其活性和結構有怎樣的影響呢？蔣經偉等[2]在研究菲律賓哈仔漆酶型酚氧化酶生化特性時發現，Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+能明顯抑制該酶的活性；周燕燕[3]研究金銀花中的多酚氧化酶時發現，不同濃度Fe2+、K+、Mg2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+等金屬離子對酚氧化酶的作用效果不同；Zheng等[4]研究湯普森無籽葡萄多酚氧化酶時發現，Zn2+和K+能夠抑制酶的活性，而Mg2+和Cu2+可以激活酶的活性；彭維等[5]研究發現不同的金屬離子對木聚糖酶和葡聚糖酶活力具有不同的影響，Na+、K+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Ca2+能激活葡聚糖酶活性，但Cu2+會抑制葡聚糖酶的活性，Na+、K+、Ca2+能激活木聚糖酶的活力。

近幾年隨著實驗技術的更新，通過紅外光譜、紫外光譜、熒光光譜等研究酶的結構變化，可以了解酶結構變化與其活性的關系。此次試驗用不同濃度的Ba2+對南美白對蝦酚氧化酶進行作用，然后研究處理后的南美白對蝦酚氧化酶活性和結構的變化，從而為金屬離子對南美白對蝦PO酶活性與結構的影響研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對蝦（Penaeus vannamei）養殖于遼寧錦州渤海灣，購買時為活蝦，將蝦保持鮮活狀態運到實驗室，用冰猝死，將其頭胸部剪下，貯藏于-80 ℃超低溫冰箱備用。

L-多巴（L-β-（3, 4-二羥基苯）-丙氨酸，L-DOPA）（BR級）、十二烷基聚乙二醇醚（Brij-35，Sigma-Aldrich），北京中生瑞泰科技有限公司；曲酸（純度99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DEAE-瓊脂糖凝膠FF（DEAE Sepharose Fast Flow）、葡聚糖凝膠G-100（Sephadex G-100），GE-Healthcare Amersham公司；其他試劑均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外-可見分光光度計，日本島津公司；蛋白電泳儀、GS-800圖像掃描儀，美國Bio-Rad公司；Milli-Q超純水裝置，美國Millipore公司；DK8D型電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；Biofuge stratos臺式冷凍高速離心機，美國Thermo Scientific公司；Scimitar2000 Near傅里葉變換紅外光譜儀，美國安捷倫公司；970CRT型熒光分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；蛋白質層析系統，上海青浦滬西儀器廠；原子力顯微鏡XE-70，Park Systems（韓國）公司。

1.3 方法

1.3.1 PO酶的制備

按照試驗組前期已取得的成果[6]，將經過分離純化、濃縮，酶活約為731 U/mL、蛋白含量約為1.2 mg/mL的PO酶，作為此次試驗用酶。

1.3.2 不同濃度的Ba2+處理PO酶

在試驗中首先測定了Cl-對試驗結果的影響，試驗中用NaCl為陰性對照進行試驗，結果表明Cl-濃度在1×10-7～1 mol/L范圍內，Cl-對PO酶活性的影響在誤差范圍內，可以忽略，因此，可以忽略Cl-的干擾。

研究不同濃度的Ba2+對PO酶活性的影響。分別配制濃度為2，1，0.001和0.000 1 mol/L的氯化鋇溶液，在室溫下，分別與8 mL的PO酶混勻，作用30 min，使Ba2+（Ba2+）終濃度為0，100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6和10-7mol/L，經過上述處理的酶，為此次試驗用酶。

1.3.3 PO酶活性的測定

將2.2 mL pH 6.8、0.067 mol/L的磷酸緩沖液和2.2 mL L-DOPA混勻，置于45 ℃的恒溫水浴鍋中，水浴2 min后，加入0.6 mL已經在45 ℃下預熱2 min的1.3.2處理后的PO酶，將反應液立即倒入比色皿，選擇紫外可見分光光度計動力學模塊，在產物的最大吸收波長475 nm下測定反應液的吸光度變化，每隔5 s記錄1次吸光度，測定8 min，選取反應體系吸光度為初速度區間數據計算酶活。一個酶活力單位（U）定義：單位體積酶液（mL）在單位時間（min）內使酶促反應體系吸光度增加0.001[7-8]，用U（或U/mL）表示，見公式（1）。

式中：ΔA為吸光度變化量；t為反應時間（min）；D為反應體系總體積（mL）/參加反應的酶液（mL）。

酶被Ba2+處理前后活性變化以相對酶活性表示，見公式（2）。

1.3.4 經不同濃度Ba2+處理的PO酶紫外光譜掃描

將濃度為10-5，10-4，10-2，10-1和0 mol/L的經Ba2+處理的PO酶進行紫外光譜測定，酶濃度進行適當稀釋，符合紫外測定要求。使用紫外可見分光光度計測定Ba2+處理的PO酶的紫外圖譜，掃描范圍為200～400 nm，狹縫寬度為1.0 nm，以未處理的PO酶為對照。

1.3.5 經不同濃度Ba2+處理的PO酶內源熒光強度測定

利用熒光光度計測定經濃度為10-5，10-4，10-2，10-1和0 mol/L的Ba2+處理的PO酶的內源熒光。試驗方法參照Liu等[9]方法加以修改。將經不同濃度Ba2+處理的PO酶液用磷酸緩沖液（0.067 mol/L，pH 7.2）進行稀釋，使終濃度為0.08 mg/mL，選擇發射波長λem=350 nm，檢測PO酶的最大激發波長λex，然后在最大激發波長下選擇發射波長范圍。確定出的激發波長λex=288 nm，發射波長λem范圍確定為200～600 nm，狹縫矯正均為5 nm。

1.3.6 經不同濃度Ba2+處理的PO酶紅外光譜的測定

將經不同濃度Ba2+處理的PO酶冷凍干燥，取適量干燥的酶與適量KBr混合壓片，使用FTIR光譜儀測定PO酶的紅外光譜。在16 cm-1分辨率下，進行400～4 000 cm-1全波段掃描，掃描200次，每個樣品檢測3次，收集樣品光譜。

參考前期相關研究[6]，采用Peak Fitv 4.12軟件，選取酰胺Ⅲ帶波段圖譜進行基線調整、去卷曲、二階求導和曲線擬合，多次擬合使殘差（r2）大于0.99，根據各子峰的峰面積計算PO酶蛋白質二級結構含量[10-11]。

2 結果與討論

2.1 不同濃度Ba2+對PO酶活性的影響

不同濃度的Ba2+對酚氧化酶進行處理，待反應結束，對其酶活進行測定。當酚氧化酶相對活性等于100%時，說明Ba2+對酚氧化酶無作用；當酚氧化酶相對活性低于100%時，說明Ba2+對酚氧化酶活性具有抑制作用；當相對活性高于100%時，說明Ba2+對酚氧化酶具有激活作用。

如圖1所示，隨著Ba2+濃度的增加，PO酶的活性變化趨勢為先上升后下降，當Ba2+濃度為10-7～10-5mol/L時，酚氧化酶活性上升較快；當Ba2+濃度為10-5mol/L時，相對酶活達到最大，即120.29%；當Ba2+濃度為10-4～10-3mol/L時，相對酶活開始下降，但酚氧化酶仍處于被激活狀態；當Ba2+濃度為10-2～100mol/L時，酶活下降較快，Ba2+對酚氧化酶活性有抑制作用。因此，當Ba2+濃度較小時，其對酚氧化酶具有激活作用，這可能是因為Ba2+的電子云排布中具有空軌道，能與酶蛋白分子中的—NH3、—COOH、—OH和CO—NH—等形成配位鍵，能夠對酶的活性中心結構有一定的維持作用；但當Ba2+濃度達到一定量后，其對酚氧化酶活性具有抑制作用，可能是過量的金屬離子促進了酶蛋白的聚集作用，減少了底物與酶的結合，降低了酶促反應速率，從而降低了酶的活性。根據Ba2+處理后的酚氧化酶活性的測定，選取經Ba2+濃度0，1×10-5，1×10-4，1×10-2和1×10-1mol/L處理后的酶進行進一步研究。

圖1 不同濃度Ba2+對PO酶活性的影響

2.2 Ba2+對PO酶結構的影響紫外光譜分析

如圖2所示，PO酶在274±1 nm附近有特征性吸收峰，其原因主要是蛋白質肽鏈上的色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）殘基的芳香雜環π→π*躍遷引起的[12]。經0 mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度為0.26；經1×10-5mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度為0.322；經1×10-4mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度為0.362；經1×10-2mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度為0.326；經1×10-1mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度為0.302。隨著Ba2+濃度的逐漸增大，吸光度呈先增大后減小的趨勢，并未發生紅移或藍移現象。結合圖1結果可以發現，當處理PO酶的Ba2+濃度為1×10-5和1×10-4mol/L時，PO酶處于激活狀態，對應紫外光譜分析，此時PO酶的紫外吸光度是增加的，說明在這樣的Ba2+濃度下，酶結構發生的變化是有利于酶與底物的結合，提高了酶的活性；當作用PO酶的Ba2+濃度為10-2和10-1mol/L時，PO酶的紫外吸光度低于對照組，可能是較高濃度的金屬離子促進了酶蛋白的去折疊化，同時金屬離子加速了蛋白分子間的聚集，結果使一部分暴露于水環境的Trp和Tyr殘基又被包埋到疏水環境中。結合圖1分析，這種改變降低了酶與底物的結合，從而降低了酶的催化活性。

圖2 不同濃度Ba2+處理后的PO酶紫外吸收光譜變化

2.3 Ba2+對PO酶結構的影響內源熒光光譜分析

蛋白質中的芳香族氨基酸具有熒光特性，而且極易受環境影響，所以蛋白質熒光強度的變化可以間接反映出空間構象的變化[13]。用波長288 nm的激發光激發經不同濃度的Ba2+作用的PO酶，結果見圖3。經不同濃度Ba2+處理的PO酶在波長337.8 nm處均出現了最高的發射峰。當Ba2+濃度為0 mol/L時，PO酶熒光強度為734.283；當Ba2+濃度為1×10-5mol/L，PO酶熒光強度上升至738.667；當Ba2+濃度為1×10-4mol/L時，PO酶熒光強度為757.609；當Ba2+濃度為1×10-2mol/L時，PO酶熒光強度開始減小，為702.352；當Ba2+濃度為1×10-1mol/L時，PO酶熒光強度為689.638。可以看出，隨著與PO酶作用的Ba2+濃度的逐漸增加，PO酶熒光強度的變化趨勢為先增大后減小，一般情況下，極性環境能影響蛋白質的生色團基團的基態和激發態能級，從而減少激發態的能量，使發射譜發生紅移或藍移現象[14]。從試驗結果可以看出，經Ba2+處理，酚氧化酶的內源熒光光譜并未發生紅移或藍移的現象，這一結果與2.2紫外光譜分析結果相一致，所以，根據這2個光譜學的分析，可以推測Ba2+處理后的PO酶三級結構變化很小。

圖3 不同濃度Ba2+處理后的PO酶熒光強度變化

2.4 Ba2+對PO酶結構的影響紅外光譜分析

FTIR光譜儀在研究蛋白質和多肽二級結構中越來越重要，尤其對于檢測非結晶態蛋白質二級結構非常重要[15]；在實際應用中，經常利用酰胺Ⅰ帶和Ⅲ帶來研究蛋白質的二級結構[16]，此次試驗選取酰胺Ⅲ帶（1 220～1 330 cm-1）波段圖譜進行蛋白質結構分析。從圖4（A）中可以看出，酚氧化酶在經過不同濃度的Ba2+處理后，在酰胺Ⅰ帶1 650 cm-1附近的峰，發生的強度變化很小，峰位也未發生位移。酰胺Ⅲ帶主要是C—N伸縮振動和N—H彎曲振動，Ba2+處理前后的PO酶在酰胺Ⅲ帶特征峰的強度和峰型均有變化，見圖4（B），對照組在1 300 cm-1和1 250 cm-1位置形成兩個峰；1×10-5mol/L的Ba2+處理的PO酶的紅外酰胺Ⅲ帶特征峰的峰型與對照組基本一致，1 250 cm-1位置強度增加；1×10-4，1×10-2和1×10-1mol/L的Ba2+處理的PO酶在1 280 cm-1位置出現一個較明顯峰，在1 242 cm-1處出現了一個峰，與對照比較，原來的1 300 cm-1和1 250 cm-1位置的峰的強度明顯變小。酰胺Ⅲ帶各子峰的歸屬：1 330～1 290 cm-1為α-螺旋，1 250～1 220 cm-1為β-折疊，1 295～1 265 cm-1為β-轉角，1 270～ 1 245 cm-1為無規則卷曲[17-18]。結合圖4（B）初步可以得出，Ba2+作用后PO酶的二級結構發生了變化。

圖4 不同濃度Ba2+離子處理后的PO酶紅外光譜圖

采用Peak Fitv 4.12對分別經不同濃度Ba2+處理的PO酶紅外光譜酰胺Ⅲ帶進行基線調整、去卷曲、二階求導、曲線擬合，經多次擬合使殘差（r2）大于0.99，根據酰胺Ⅲ帶各子峰歸屬二級結構類型，依據相應吸收峰面積百分比得出相應二級結構含量，結果見表1。從表1中可以看出，分別經不同濃度Ba2+處理的南美白對蝦PO酶與未處理的PO酶相比，二級結構空間構象類型含量發生了變化，未處理的PO酶含有20.69%的α-螺旋，27.54%的β-折疊，22.52%的β-轉角和29.25%的無規則卷曲。經1×10-5mol/L Ba2+處理的PO酶，α-螺旋和β-轉角含量比對照組增加，無規則卷曲和β-折疊含量減少。經1×10-4mol/L Ba2+處理的PO酶，α-螺旋和無規則卷曲含量比對照組減少，β-轉角和β-折疊含量比對照組增加，結合圖1可以發現，經這2個濃度的Ba2+處理的PO酶活性是增加的。經1×10-2和1×10-1mol/L Ba2+處理的PO酶，α-螺旋、β-轉角和β-折疊含量比對照組高，無規則卷曲含量比對照組低，結合圖1可以發現，經這2個濃度的Ba2+處理的PO酶活性是降低的。在蛋白質中，α-螺旋和β-折疊一般不是酶的活性中心，也不是配體以及底物的結合中心，主要是穩定蛋白質空間結構的[17]，從表1中可以看出，經Ba2+處理的PO酶的α-螺旋和β-折疊均發生了變化，說明PO酶的空間構象發生了變化，趨向不穩定狀態變化，結合圖1結果，分別經10-5和10-4mol/L的Ba2+處理的PO酶活性是增加的，說明這種變化在最初的時候是有利于酶與底物的結合，對酶具有激活作用，其原因可能是適當濃度的金屬離子的加入，使得酶與金屬離子間發生水合作用，增加了酶與底物間的接觸面積，增加了底物進入到酶活性中心的機會，所以酶活性增加。隨著Ba2+濃度的增加，PO酶肽鏈上的側鏈氨基酸展開，酶分子間容易發生聚集，活性中心被包埋，影響底物與酶之間的結合，最終導致酶活性降低。

表1 不同濃度Ba2+處理的酚氧化酶二級結構含量

3 結論

此次試驗研究了Ba2+對南美白對蝦酚氧化酶活性和結構的影響，隨著Ba2+濃度的不斷增加，酚氧化酶的活性呈先增加后減小的趨勢。紫外光譜、熒光光譜研究表明，Ba2+使PO酶的紫外光譜和熒光光譜均發生了改變，但內源熒光光譜最大發射波長并未發生移動現象，說明Ba2+對PO酶三級結構影響比較小。紅外光譜分析發現，Ba2+使PO酶的二級結構空間構象類型、含量均發生了變化，α-螺旋和β-折疊的變化可以說明PO酶的空間構象發生了變化，趨向不穩定狀態變化，低濃度的Ba2+使PO酶發生的這種變化，對酶具有激活作用；隨著Ba2+濃度的增加，PO酶活性開始降低。