L-谷氨酸對蘋果果實抗氧化能力的影響

楊佳麗，荊志懷，張星，王如福

山西農業大學食品科學與工程學院（晉中 030801）

蘋果（Malus domesicaBorkh.）營養豐富，兼具食用、藥用價值，產銷需求旺盛，是我國傳統的大宗水果之一[1]。蘋果屬呼吸躍變型果實，在采后貯運期間易被病原菌侵染，尤其是由擴展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病會造成果實發生大范圍的腐爛[2]。目前，化學殺菌劑依然是控制采后真菌病害最行之有效的方法，但其頻繁使用會對環境和食品安全產生較大的危害。利用誘導因子激活果實內在的抗性機制已成為當前果蔬采后病害防治中的研究熱點[3]。

L-谷氨酸是植物體內一種非常重要的氨基酸，不僅參與多種氨基酸的合成，且調節著一些重要的生理代謝過程，尤其是以其為前體物質的代謝產物（如γ-氨基丁酸、精氨酸、脯氨酸），與植物的抗逆境脅迫密切相關[4]。已有研究顯示，L-谷氨酸在植物響應外界非生物脅迫時可能發揮重要作用[5]。然而目前有關L-谷氨酸在植物與病原菌互作中的作用還鮮有報道。近年來，有研究提出L-谷氨酸代謝參與了植物的防御反應，同時其參與方式可能與病原菌的種類有關[6]。前期的研究中也首次明確了L-谷氨酸可作為一種理想的化學誘導因子激發番茄果實對黑斑病產生抗性，且其抗性機制可能與碳氮代謝有關[7]。為進一步揭示L-谷氨酸的誘抗機制、擴大其適用范圍，以蘋果果實為研究對象，探討L-谷氨酸對果實青霉病的抑制效果以及作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用的紅富士蘋果（Malus domesicaBorkh. cv.Fuji）產地為山西運城，購于山西晉中當地的水果批發市場。挑選大小均勻、無機械損傷、成熟度一致的果實進行試驗；Penicillium expansum為實驗室保藏菌種。

L-谷氨酸，分析純，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，使用前將其pH調至7左右，并用0.45 μ m濾膜處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

Penicillium expansum在PDA培養基中28 ℃條件下培養7 d，利用無菌水將病原菌孢子洗出，隨即利用血球計數板將孢子懸浮液調整至所需濃度，備用。

1.2.2 原料處理及取樣

前期研究顯示0.1 g·L-1L-谷氨酸可有效抑制青霉病病害的發生，此次試驗選用此濃度開展后續研究。在果實表面赤道位置用滅菌打孔器制造2個大小深度一致的孔（直徑約5 mm，深度約2 mm），分別注入30 μ L的無菌水和0.1 g·L-1L-谷氨酸溶液。在恒溫、恒濕條件下（25 ℃，相對濕度約95%）誘導處理24 h，然后向每個孔接入20 μL的青霉菌孢子懸浮液（104spores·mL-1），并用保鮮膜密封置于恒溫恒濕箱中。貯藏期間每天定時觀察果實的發病情況，同時取病斑周圍的果肉組織，立即用液氮凍存，置于-80℃下備用。每個處理重復3次，每個重復至少9個果實，整個試驗重復2次。

1.3 項目測定

1.3.1 發病率和病斑直徑的測定

發病率按式（1）計算。病斑直徑用十字交叉法取平均值。

發病率=發病果實/總果實數×100% （1）

1.3.2 抗氧化酶活性和丙二醛含量的測定

過氧化物酶（Peroxldase，POD）活性測定參照Lurie等[8]的愈創木酚法；過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性測定依據Aebi等[9]的方法；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）利用南京建成生物工程研究所試劑盒測定；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量參照余辰[10]的方法測定。

1.3.3L-脯氨酸和草酸含量的測定

L-脯氨酸和草酸含量利用氣相色譜質譜聯用技術（GC-MS技術）分析測定。樣品的提取和衍生化處理參照Pedreschi等[11]的方法進行。

GC-MS反應條件：采用TR-5色譜柱（30 m×0.25 mm內徑，0.25 μm膜厚）；載氣，氦氣（流速1.0 mL·min-1）；升溫程序，柱溫70 ℃保留2 min，以10 ℃·min-1升高至220 ℃，最后以20 ℃·min-1上升到260 ℃保留3 min；分流進樣，進樣量1 μL，流速5 mL·min-1，分流比5∶1；電離方式，電子轟擊離子源（EI），電子能量70 eV；傳輸線溫度，240 ℃；全譜掃描質量范圍，m/z50～650。

1.4 數據分析

試驗數據利用SPSS/PC ver. II.x軟件進行Duncan’s差異分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 外源L-谷氨酸對蘋果青霉病的影響

如圖1所示，隨著接種時間的延長，果實的發病率和病斑直徑逐漸上升。在圖1（A）中，蘋果在接種3 d 后，對照組發病率達到48.1%，而L-谷氨酸處理組僅為27.8%；在接種第4天時，相對于對照組，處理組發病率下降了27.8%。與發病率類似，L-谷氨酸處理組的病斑直徑也顯著低于對照組（圖1B），尤其是在第3天時，處理組降低了約44.9%?？梢奓-谷氨酸對蘋果青霉病有較好的抑制效果。

圖1 L-谷氨酸對蘋果青霉病的影響

2.2 外源L-谷氨酸對丙二醛含量的影響

當植物體內的活性氧大量積累時會誘發膜脂過氧化產物MDA的增加。如圖2所示，果實自被侵染24 h后，MDA含量呈逐步上升趨勢，且處理組在侵染過程中低于對照組，尤其是在72 h時，對照組為處理組的1.37倍。

2.3 外源L-谷氨酸對果實抗氧化酶活性的影響

植物在長期進化中形成了應對外界環境脅迫時產生的自我防御系統，如抗氧化酶系統。如圖3（A）所示，POD活性整體呈先升后降的趨勢，在接種病原菌后的前24 h，L-谷氨酸處理組明顯高于對照組，具體來說在0 h和24 h時，POD活性分別為對照組的1.46倍和1.21倍。同時圖3（B）中的結果顯示，經L-谷氨酸處理后的果實在被病原菌侵染前期，CAT活性迅速上升，而后雖趨于平緩，但在整個侵染過程中依然高于對照組，尤其在24 h達到峰值時，約為對照組的2.11倍。SOD活性在處理期間的變化趨勢與上述POD和CAT類似，可被L-谷氨酸快速誘導提高（圖3C）。

圖2 L-谷氨酸對MDA含量的影響

圖3 L-谷氨酸對抗氧化酶活性的影響

2.4 外源L-谷氨酸對L-脯氨酸和草酸含量的影響

已有文獻報道，L-脯氨酸和草酸可作為有效的抗氧化劑，可清除活性氧。GC-MS分析結果顯示，在病原菌侵染早期（24 h），蘋果經外源L-谷氨酸處理，其體內的脯氨酸含量與對照組并無差異，隨著病害的進一步發展，達到72 h時，L-谷氨酸約為對照組的1.43倍（圖4A）。試驗還發現，L-谷氨酸對果實中草酸的含量也會產生一定的影響，如圖4（B）所示，相比于對照組，L-谷氨酸處理組中的草酸含量顯著增加，尤其是在72 h時，草酸含量提高了26.9%。

圖4 L-谷氨酸對L-脯氨酸和草酸的影響

3 討論與結論

在前期研究中已初步證實L-谷氨酸可作為一種激發因子，有效抑制由Alternaria alternata引起的番茄黑斑病[7]。在此次試驗中，蘋果果實經0.1 g·L-1L-谷氨酸誘導處理，可以顯著降低青霉病的發病率和病斑直徑，抵御病原菌P.expansum的侵染，這與L-谷氨酸對A.alternata的作用規律一致。P.expansum是典型的腐生型病原菌，其營養獲取主要是來自死亡的宿主細胞或組織。當植物被病原菌侵染時，其體內會產生大量的活性氧，從而誘發膜脂過氧化和膜透性喪失，最終導致宿主細胞受到傷害甚至死亡，也就是說活性氧在果實體內的大量積累非常利于腐生型病原菌的侵染[11]。然而植物在長期的進化中形成了一套完善有效的活性氧清除系統保護機體免受傷害，如抗氧化酶系統。在該系統中，SOD可催化超氧陰離子自由基，歧化生成O2和H2O2，POD和CAT等抗氧化酶可將活性氧H2O2分解為O2和H2O，從而抑制過量活性氧的積累，減弱膜脂過氧化造成的細胞膜系統損傷，其中MDA可作為衡量膜脂過氧化程度的一個重要指標[12]。此次試驗發現，蘋果在被P.expansum侵染時，L-谷氨酸會迅速誘導果實抗氧化酶POD，CAT和SOD活性的提高，并能有效抑制MDA的積累。這與Yang等[13]的研究結果類似，番茄果實經外源GABA處理后增強對A.alternata的抗性，可能與提高抗氧化酶活性有關。也就是說，L-谷氨酸可能是通過激活果實體內的抗氧化酶系統，阻止過量活性氧產生和膜脂過氧化。

近年來的研究表明，植物體內積累的活性氧還可以通過抗氧化劑來清除，如脯氨酸和草酸[14]。草酸是廣泛存在于動植物體內的一種代謝產物，可通過與金屬離子螯合劑發生Fenton反應來影響機體內的活性氧代謝[15]。目前，草酸已作為天然的抗氧化劑，被廣泛應用于果蔬保鮮領域。有研究發現，桃果實在被草酸處理后，果肉中的H2O2和超氧化物自由基含量會明顯降低[16]。脯氨酸作為蛋白氨基酸之一，可在吡咯琳-5-羧酸合成酶（P5CS）和吡咯琳-5-羧酸還原酶（P5CR）的催化下由L-谷氨酸作為底物直接合成。脯氨酸在參與響應植物逆境脅迫中占據重要地位，尤其是在抗滲透脅迫中，可作為一種惰性的相容性滲透物質，來調節細胞質和液泡間的滲透壓平衡[17]。同時，有研究報道脯氨酸還可以作為一種有效的抗氧化劑清除活性氧，通過與抗氧化酶系統協同作用調控機體內活性氧的平衡[18]。此次試驗發現，蘋果在遭受病原菌的侵染時，L-谷氨酸處理會提高果實體內抗氧化劑草酸和脯氨酸的含量，這可能會抑制活性氧的大量生成，從而給予果實對P.expansum產生更強的抗性。

L-谷氨酸作為化學誘導因子，因其生產貯藏成本低，容易獲得且安全環保，在果蔬采后病害領域內具有廣闊的商業應用前景。通過研究L-谷氨酸對蘋果抗氧化能力的影響發現，其對腐生型病原菌P.expansum的抗性機制可能與抗氧化酶系統的激活和某些抗氧化劑（如L-脯氨酸和草酸）的積累有關，從而阻止活性氧對宿主細胞的傷害，這將為L-谷氨酸作為新型化學誘導劑的商業化提供一定的理論依據。