市售高鹽稀態醬油中氨基甲酸乙酯含量的調查分析

王軍喜，何一龍，劉曉艷*，白衛東，錢敏，趙文紅

1. 廣東粵師傅調味食品有限公司（開平 529341）；2. 仲愷農業工程學院輕工食品學院（廣州 510225）

氨基甲酸乙酯（EC），又名尿烷。20世紀70年代，由外國學者在發酵食品中首次發現[1]，是食品在發酵和儲藏過程中產生的天然副產物，廣泛存在于傳統發酵食品中（包括面包、酸牛奶、葡萄酒、豆豉、黃酒、釀造醬油和食醋等）[2-3]。EC于2007年被世界衛生組織（WHO）認定為“2A”級致癌物[4]。EC具有口服毒性，但急性低，麻醉小型嚙齒類動物的單次劑量需達到1 000 mg/kg mb以上；研究發現，長期攝入EC會導致試驗小鼠體質量和存活率下降及腫瘤的發生。人體攝入EC質量濃度超過30 μg/L后，患癌概率增加，可導致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病[5-6]。

醬油作為一種區域性強的發酵型調味品，在亞洲國家生產和食用量較大。醬油中的精氨酸、瓜氨酸含量非常豐富，且在發酵過程中會有一定濃度的尿素及乙醇產生。EC可由尿素、瓜氨酸和乙醇自發反應生成[7-8]。有學者研究發現，在葡萄酒釀造的酒精發酵后期，精氨酸代謝產生的瓜氨酸、尿素等物質會與乙醇發生緩慢的化學反應生成EC，但以尿素為主[9]。在黃酒的研究中同樣認為EC是乙醇與尿素反應生成為主[10]。醬油中EC的主要前體物質被認為與瓜氨酸關系較大[11]。醬油的釀造時間長，也為EC的形成提供了條件。然而，目前我國尚未制定發酵食品和酒精飲料中EC的限量標準，也未引起足夠重視。在非酒類食品中，醬油中EC含量要顯著高于其他食品[12-13]，國內對于醬油中EC的研究較少，且安全問題未進行合理評估。隨著醬油消費量日漸增加，分析我國醬油中EC含量水平，評估廣東傳統釀造醬油中EC的現狀勢在必行。試驗利用固相微萃取-氣質聯用（SPE-GC/MS）法對市售35種廣式傳統釀造高鹽稀態醬油中的EC進行調查分析，試驗結果為醬油的安全生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油樣品（市售）。

EC標準品（純度＞99%，美國Sigma公司）；氨基甲酸乙酯標準品、D5-氨基甲酸乙酯（nPC，純度≥98.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；甲醇（色譜純）、二氯甲烷（分析純）：廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

GC-MS（6890-5973i，美國安捷倫公司）；INNONWAX毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μ m，美國安捷倫公司）；旋轉蒸發儀（RE-52c，鞏義市予華儀器公司）；氮吹儀（MD200-1，江蘇盛藍儀器制造有限公司）；恒溫磁力攪拌器（78HW-1，金壇市國旺實驗儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

參照GB 5009.223—2014方法稍有改動。準確稱取2 g醬油樣品于10 mL具塞試管中，加入100 μL 2 μg/mL的D5-氨基甲酸乙酯溶液，超聲使其溶解，混勻后真空條件下將樣液緩緩倒入堿性硅藻土固相萃取小柱并靜置10 min。經適量正己烷淋洗后，用適量5%乙酸乙酯-乙醚溶液以流速1 mL/min進行洗脫，洗脫液經裝有適量無水硫酸鈉的漏斗脫水后，收集到10 mL刻度試管中，室溫下氮氣吹至約0.5 mL，用甲醇定容至1.00 mL，上機檢測。

1.3.2 GC-MS色譜條件

色譜柱：HP-INNOWAX 30 m×0.25 mm（內徑）×0.2 μm（膜厚）；進樣口溫度220 ℃；SIM模式掃描；進樣量1 μL；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；流速1.2 mL/min；不分流；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至240 ℃，保持5 min。

1.3.3 標準曲線的繪制

結合唐雙雙等[14]和崔海灝等[15]的方法，稍作改動。準確稱取氨基甲酸乙酯標準品，用甲醇定容至0.5 μg/mL，同樣方法稱取D5-氨基甲酸乙酯（D5-Ethyl carbamate）標準品，甲醇定容至2 μg/mL；分別準確吸取氨基甲酸乙酯標準溶液（0.5 μ g/mL）于容量瓶中定容，得到質量濃度為10，25，50，100和200 ng/mL的標準中間液，準確吸取100 μL 2 μg/mL D5-氨基甲酸乙酯標準液，分別加入到各濃度標準中間液，得到標準工作液，現配現用。

1.3.4 結果分析

數據均使用SPSS Statistic 17.0軟件進行分析，采用Origin 8.6軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 EC的檢測方法

以固相萃取法萃取醬油中EC，參考文獻發現EC蒸汽壓較高，易升華，外標法定量回收率低，目標物損失較大，故試驗采用內標法定量檢測，以D5-氨基甲酸乙酯作為內標物，用GC-MS定量分析[16]。以離子色譜峰面積與其對應濃度作線性回歸，得到標準曲線y=1.305 063x+0.025 213（R2=0.999 4），線性結果較好。

2.2 醬油中EC的含量調查

從廣州各市區隨機購得35個醬油樣品，均為廣東本地品牌且被生產企業標注為釀造醬油，所用的工藝均為高鹽稀態工藝（GB/T 18186）。

檢測35個市售高鹽稀態醬油樣品中氨基甲酸乙酯含量，結果如表1所示。被調查樣品來自7個不同品牌，Z牌、W牌、R牌、L牌、H牌、D牌和C牌分別占樣品總數的20.0%，14.3%，11.4%，14.3%，28.6%，2.9%和8.8%。其中特級、一級、二級和三級醬油（氨基酸態氮不低于0.8，0.7，0.55和0.4 g/mL）分別占全部樣品的40%，17.1%，14.3%和28.6%。在調查樣品中均有檢出EC，其范圍為2.9～104.2 μg/kg，平均值為16.9 μg/kg，中位值為11.2 μg/kg；與王立媛等[17]調查浙江市售醬油中EC含量1.6～80.8 μg/kg有所差異；試驗調查樣品主要集中在廣州市售高鹽稀態醬油，由于地域差異，醬油的釀曬工藝存在不同，導致兩地醬油中EC含量也存在差異，EC含量略高于浙江。

表1 市售醬油中EC含量的調查

2.3 醬油中EC含量的統計分析

2.3.1 不同品牌醬油中EC含量次數分布統計分析

不同品牌醬油中EC的統計結果，詳見表2和表3。EC含量高于100 μg/kg有1個，占2.9%；EC含量在50～100 μg/kg之間的有2個，占5.7%；EC含量在20～50 μg/kg之間有3個，占8.6%；EC含量在10～20 μg/kg之間有13個，占37.1%；EC含量在10 μg/L以下的16個，占45.7%。被調查醬油中EC含量主要在0～20 μg/kg之間，占總樣品的82.9%，結果表明廣州市售醬油大部分安全。在7個品牌中，EC含量平均值最大的為C品牌，達到41.2 μg/kg，其次是H品牌（23.3 μg/kg）；平均值最小的為R牌（7.0 μg/kg）；EC含量中間值最大的是H牌，為16.0 μg/kg，最小的為R牌（5.5 μg/kg）；EC含量最大值最高的是C牌（104.2 μg/kg），其次是H牌（72.8 μg/kg）；R牌最小值為2.9 μg/kg，是所有品牌中最小值最小的。

表2 醬油中氨基甲酸乙酯含量的次數分布表（n=35）

表3 不同廠家醬油中EC含量描述性統計結果

2.3.2 不同等級醬油中EC含量的統計分析

由圖1可以看出，一級醬油中EC含量主要在0～10 μg/kg之間；二級、三級主要在0～20 μg/kg之間；特級醬油各區間均含有EC檢出（0～10，10～20，20～50及50 μg/kg分別占11.4%，14.3%，5.7%和8.6%）；不同等級醬油中EC含量差異較大，部分特級醬油中EC含量偏高，但總體明顯高于其他等級的醬油；這可能與特級醬油中氨基酸態氮含量高于一級、二級和三級有關，氨基酸態氮含量越高，醬油中游離氨基酸越多，前體物精氨酸、瓜氨酸含量越高，EC更容易形成。二級、三級醬油經過二次三次淋油，其具有更多時間進行乙醇發酵和尿素生成，所以二級、三級醬油中EC含量略高于一級醬油。

圖1 不同等級醬油中氨基甲酸乙酯（EC）含量對比

3 結論與討論

通過SPE-GC/MS法對廣東35個醬油樣品中EC含量進行檢測調查，結果表明，EC含量高于100 μg/kg有1個，在50～100 μg/kg之間有2個，在20～50 μg/kg之間有3個，在10～20 μg/kg之間有13個，在10 μg/L以下有16個，分別占總數的2.9%，5.7%，8.6%，37.1%和45.7%；EC含量主要在0～20 μg/kg之間，占總樣品的82.9%，說明廣州市售醬油大部分是安全的。但EC含量高于20 μg/kg的占17.1%，且有一個樣品的EC含量高于100 μg/kg，醬油中的EC問題也不容忽視。特級醬油中EC含量明顯高于其它等級，各品牌EC含量差異明顯，這可能與其釀造工藝有關；釀造醬油都要經過選料、蒸煮、制曲、釀曬、滅菌、沉淀、調味等加工工序[18]，除選料、蒸煮和沉淀以外，制曲、釀曬、滅菌工藝根據各自特色有所差異；不同品牌、發酵時間、滅菌工藝及調配工藝不同會導致產品EC含量不同。