液質聯用法測定堅果類的苯丁錫

萬承波，林黛琴，王婷婷，鐘永生，楊標斌，黃磊

江西省產品質量監督檢測院（南昌 330029）

苯丁錫（Fenbutatin oxide）又名螨完錫，屬于一種有機錫農藥，是一種殺螨劑，分子式為C60H78OSn2，對有機氯和有機磷產生抗性的螨類害蟲能有效防治，被廣泛用于果蔬、茶樹等作物，易通過食物鏈進入生物體內產生生物富集，對人體和動物有一定的毒性。目前我國、日本及歐盟等均對食品中的苯丁錫作出相應的限量規定。我國在黃瓜、香蕉等蔬菜水果、堅果類食品中均有限量規定，GB 2763—2019中限量范圍在0.5～10 mg/kg之間，推薦方法為SN 0592—1996《出口糧谷及油籽中苯丁錫殘留量》；日本肯定列表制度規定部分水果蔬菜中的苯丁錫殘留限量為0.05 mg/kg；歐盟關于苯丁錫使用限量規定最為嚴格，在蔬菜、谷物、牛奶雞蛋等動物產品中的最大殘留限量為0.01 mg/kg。

目前國內報道的有機錫類農藥的檢測分析方法主要有氣相色譜（FPD、ECD）法[1-5]、氣相色譜質譜法[6-7]、液相色譜質譜法[8-10]、液相色譜-電感耦合等離子體質譜法[11-12]、紅外光譜法[13]等。有機錫化合物沸點高，氣相色譜直接進樣不能氣化，衍生反應后還需要凈化才能進樣，缺點主要集中在過程繁瑣、衍生條件苛刻以及存在不穩定性且耗時費力，難以實現通量檢測；目前我國對苯丁錫有限量值規定的包括蔬菜、水果、干制水果以及堅果類，基質種類較為復雜，采用紫外光譜法容易造成假陽性的存在；采用液相色譜串聯質譜法無需衍生、操作簡便、節省溶劑、穩定性好，適合高通量檢測。

檢索文獻發現，目前報道的苯丁錫含量檢測方法的適用范圍局限在蔬菜、水果、糧谷、畜禽肉中，尚未有堅果類中苯丁錫含量的檢測方法報道，油脂油料基質復雜，含有大量的蛋白質、脂肪等干擾物，建立一種液相色譜串聯質譜法測定堅果類中苯丁錫含量的分析方法很有必要。此次試驗擬針對堅果類基質，選取比較有代表性的杏仁、核桃仁為研究對象，建立一種簡便、快速且準確度高的液相色譜串聯質譜法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters-UPLC I-Class高效液相色譜儀，AB SCIEX TRIPLE QUAD 5500質譜儀；空氣控溫搖床儀KS400i；離心機3K15（Sigma）；電子天平（感量0.1 mg，Sartorius，德國）；渦旋振蕩儀（IKA）。

苯丁錫標準品（純度98.0%，Bepure）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA，40～60 μm，安捷倫，美國）；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，40～60 μm，安捷倫，美國）；乙酸銨（色譜級，阿拉丁公司）；無水硫酸鎂（分析純，廣州化學試劑）；氯化鈉（分析純，廣州化學試劑）；甲酸（色譜級，阿拉丁公司）；乙腈、正己烷（色譜純，默克爾公司）。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱，Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μ m）；柱溫，40 ℃；流動相A，5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水；流動相B，甲醇；流速，0.4 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.3 min，10% B；0.3～2 min，10%～100%B；2～5 min，100% B；5～5.1 min，100%～10% B；5.1～6 min，10% B。進樣體積：2 μL。

1.2.2 質譜條件

離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，正離子模式；離子源溫度，550 ℃；CUR，0.207 MPa；IS，5 500 V；GS1，0.379 MPa；GS2，0.379 MPa。掃描模式：多重反應監測MRM模式，見表1。

表1 質譜條件

1.3 測定步驟

1.3.1 標準溶液配制

苯丁錫儲備液的配制：準確稱取25.0 mg苯丁錫于250 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得到100 μg/mL標準儲備溶液，于4 ℃保存。

1.3.2 樣品前處理

稱取4.0 g（精確至0.01 g）試樣置于50 mL塑料離心管中，加入20 mL正己烷飽和的乙腈，以300 r/min振蕩提取40 min，加入4.0 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉，劇烈振蕩2 min，離心分層。取2 mL上清液至加有40 mg C18粉的2.5 mL離心管中，渦旋1 min，離心3 min。準確移取1 mL上清液，于40 ℃氮吹至近干，用1 mL乙腈-0.1%甲酸水（3∶2，V/V）定容，過膜上機待測。

1.3.3 定性及定量測定

以樣品中目標化合物色譜峰的保留時間和相應基質標準色譜峰的保留時間比較，誤差絕對值應不超過2.5%。為減少基質對目標物定量測定的影響，該方法采用基質標準曲線-外標法定量測定，標準溶液采用基質混合標準工作溶液繪制標準曲線。

2 結果與討論

2.1 儀器方法優化

2.1.1 流動相種類以及流速的優化

分別考察了0.1%甲酸水（5 mmol/L乙酸銨）溶液-乙腈以及0.1%甲酸水（5 mmol/L乙酸銨）溶液-甲醇2種流動相體系。結果顯示，同等濃度的苯丁錫標準溶液在0.1%甲酸水（5 mmol/L乙酸銨）溶液-乙腈體系中響應低且色譜峰展寬。分析原因：乙腈的洗脫能力比甲醇強，同等比例的乙腈和甲醇，含乙腈的溶解液會導致峰展寬現象更為嚴重，且甲醇提供質子的能力比乙腈強，甲醇更適合正離子監測模式，最終采用0.1%甲酸水（5 mmol/L乙酸銨）溶液-甲醇的流動相體系。

進一步對流動相流速進行優化，考察了0.3，0.4和0.5 mL/min三種流速。結果顯示，當流速增加至0.4 mL/min后，苯丁錫的峰寬無明顯變化。此外，出于對儀器以及色譜柱的保護，最終選擇0.4 mL/min的流速。

2.1.2 質譜條件的優化

此次試驗采用針泵流動注射進樣，在ESI正離子模式下進行母離子掃描，從圖1中可見其存在多簇離子峰，與儀器自帶軟件功能Isotopic distribution得出的同位素分布豐度圖吻合，已報道的液相色譜質譜法均采用517.2作為母離子，此次試驗創新性地選取響應最強的519.2（C30H39Sn-）作為母離子。苯丁錫分子式為C60H78OSn2，錫含有10個穩定的同位素（質量數分別為112，114，115，116，117，118，119，120，122和124）[14]，其中120（Sn）的豐度最大，這進一步解釋了選取519.2作為苯丁錫母離子的合理性，故選擇響應較強的519.2作為母離子。進一步進行子離子掃描（Product ion scan），選擇463.1，351.0和196.8為子離子（圖2）。選擇517.2作為母離子，進一步掃描子離子并優化碰撞能（CE）、去簇電壓（DP）等參數，采用MRM模式進樣，雖然也可以滿足靈敏度要求，但選用519.2作為母離子靈敏度更高，更有利于方法研究。

2.2 前處理方法優化

2.2.1 提取溶劑選擇

此次試驗對象為堅果類基質，其富含油脂和蛋白，苯丁錫為極性分子，難溶于大多數有機溶劑；分別考察了正己烷、乙腈、正己烷飽和的乙腈為提取溶劑，結果發現正己烷提取效率最低，乙腈和正己烷飽和的乙腈最好，但是正己烷飽和的乙腈提取到的干擾物質更少，主要是因為樣品基質富含油脂緣故。最終選取正己烷飽和的乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 除水劑用量的選擇

無水硫酸鎂相較無水硫酸鈉具有更好的吸水能力，考察了1，2，3，4和5 g無水硫酸鎂對苯丁錫提取回收率的影響。隨著無水硫酸鎂用量的增加，回收率逐漸提高，當用量大于4 g時，苯丁錫回收率逐漸下降，故最終選擇添加4 g無水硫酸鎂。

2.2.3 凈化材料的選擇

目前農藥殘留測定中運用比較廣泛的分散固相萃取凈化材料主要有石墨炭黑（GCB）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅膠鍵合相（C18）等，此次試驗主要考察以上3種凈化材料比例用量對目標物提取效率的影響。結果發現，加入GCB、PSA凈化后，樣品中苯丁錫回收率明顯下降。分析原因是苯丁錫為多苯環結構物質，石墨炭黑是平面結構材料，相似相溶，可能導致苯丁錫被吸附從而導致回收率下降；乙二胺-N-丙基硅烷對苯丁錫有吸附，可能是由于分子間的作用力。C18粉對于小極性和非極性干擾物具有很好的吸附作用，可吸附脂肪等干擾物，堅果類基質的干擾物主要是蛋白質和脂肪，進一步對C18用量做了優化。將1.2.1前處理提取液分別用10，20，40，60和100 mg C18粉進行凈化，結果顯示，當C18粉用量大于40 mg時，回收率逐漸降低（圖3）；故C18粉的最佳用量為40 mg。

圖1 苯丁錫全掃質譜圖-同位素分布圖

圖3 不同質量C18粉用量對苯丁錫回收率影響

2.3 線性范圍和定量限

準確稱取4.0 g陰性樣品，按照1.2.1處理方法處理，制得若干基質空白提取液，并以之逐級稀釋得到一系列質量濃度（0.10，0.20，0.50，1.00，2.00和5.00 ng/mL），以苯丁錫定量離子峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，其回歸方程為Y=6.8×104X+1.2×105（r=0.999 4）。定量限以10倍S/N計算，該方法定量限為0.50 μg/kg。

2.4 回收率和精密度試驗

采用1.2.1前處理方法，分別在杏仁、核桃仁中添加不同濃度水平的苯丁錫進行加標回收試驗，結果如表2所示。該方法的回收率均在81.7%～89.7%之間，相對標準偏差在1.10%～4.56%之間。

表2 方法回收率和精密度

3 結論與討論

此次試驗建立了液相色譜串聯質譜法測定堅果類中苯丁錫的檢測方法，該方法前處理簡便、靈敏度高，定量限可達0.50 μg/kg，適用于堅果中苯丁錫的定性、定量檢測。此次試驗彌補了堅果類中苯丁錫檢測方法的缺失，同時也為苯丁錫相關液質標準方法的制定提供參考。