擬除蟲菊酯類農藥多殘留酶聯免疫方法的建立

趙妍，余從田，魏新林*

1. 上海交通大學農業與生物學院（上海 200240）；2. 光明食品集團（上海 200040）

擬除蟲菊酯類農藥是根據天然除蟲菊酯的化學結構和生物活性改造得到的一類仿生農藥，具有殺蟲活性高、半衰期短、對哺乳動物毒性低等優點，在農業和衛生害蟲防治方面得到廣泛的應用[1-3]。然而，有研究表明長期低劑量攝入擬除蟲菊酯對哺乳動物的神經系統、免疫系統和遺傳物質具有潛在的慢性毒性效應[4-6]。因此，開發擬除蟲菊酯類農藥檢測方法對保障消費者安全和健康具有重要意義。

目前，擬除蟲菊酯類農藥的檢測方法主要有氣相色譜法[7]、高效液相色譜法[8]、色譜-質譜聯用法[9]、光譜分析法[10]和免疫分析法[11-12]等。然而，儀器分析方法存在操作復雜、成本高昂、專業要求高等問題，不能應對靈活多變的檢測場景。相比較而言，酶聯免疫吸附分析（ELISA）方法利用抗原抗體特異性結合的特點，靈敏度高、反應時間短、不需要專業的操作手法，對檢測人員和檢測場地的要求不高。此外，如果使用廣譜抗體，能夠識別結構相似的一類物質，可以實現多殘留檢測，更加適合現場大量樣品的篩查。理論上，選擇合適的包被抗原與相應的抗體匹配，可以提高間接競爭ELISA方法的靈敏度和檢測范圍。

此次試驗從工作濃度、親和常數、靈敏度和交叉反應等方面，考察不同方法制備的包被抗原與擬除蟲菊酯單克隆抗體的匹配程度，并從中選擇最佳包被抗原，然后對間接競爭ELISA的反應條件進行優化，最終建立擬除蟲菊酯類農藥的多殘留酶聯免疫檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

擬除蟲菊酯標準品（德國DR.E公司）；擬除蟲菊酯單克隆抗體（無錫杰圣杰康生物）；3-苯氧基苯甲酸（PBA，日本TCI公司）；雞卵清蛋白（OVA）、Tween-20、明膠、3, 3’，5, 5’-四甲基聯苯胺（TMB）、HRP標記的羊抗鼠IgG抗體（酶標二抗）：北京索萊寶公司；其余試劑：國藥公司。

ELISA試驗所用緩沖溶液參考陳燕妮[13]的配方。

1.2 方法

1.2.1 包被抗原的合成與鑒定

分別采用EDC法和混合酸酐法將PBA與OVA偶聯制備包被抗原[14]，反應摩爾比（PBA∶OVA）為30∶1，45∶1和60∶1。將PBA、OVA和包被抗原分別進行紫外波長掃描，波長范圍為200～400 nm。

1.2.2 包被抗原與抗體的親和常數測定

按照非競爭ELISA方法[15]測定各包被抗原與抗體的Ka。將抗原和抗體分別從1和10 μg/mL開始二倍比稀釋4個和8個濃度，兩兩交叉分布進行測定，每組設置3次平行。親和常數（Ka）按式（1）[15]計算。

式中：n為每組數據中兩個包被抗原濃度的比值，大于1；[Ab′]t和[Ab]t分別為OD450nm降低1/2時對應的抗體濃度，mol/L。

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1.2.3 間接競爭ELISA方法的操作過程

包被：添加包被抗原，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，洗滌液洗滌3次，250 μL/孔（下同）。封閉：添加封閉液，100 μL/孔，37 ℃封閉2 h，洗滌。競爭反應：先后添加適宜濃度的菊酯標準品和抗體，50 μL/孔，37 ℃孵育30 min，洗滌。酶標二抗：稀釋3 000倍，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，洗滌。顯色：配制新鮮顯色液，100 μL/孔，37 ℃避光反應15 min，然后加入50 μ L/孔終止液。測定：用酶標儀測定OD450nm的值。

1.2.4 建立擬除蟲菊酯標準抑制曲線

利用間接競爭ELISA方法測定不同質量濃度擬除蟲菊酯的OD450nm值，檢測結果用Origin軟件進行四參數Logistics函數擬合，繪制標準抑制曲線，并計算抑制中濃度（IC50）。

1.2.5 擬除蟲菊酯的交叉反應試驗

按照1.2.4的方法分別測定其他擬除蟲菊酯的IC50值，根據式（2）計算11種擬除蟲菊酯類農藥以及半抗原與抗體的交叉反應率（Cross-reactivity，CR）。

2 結果與分析

2.1 包被抗原的鑒定

根據擬除蟲菊酯的母核結構選擇PBA（化學結構見表3）作為包被半抗原。PBA、OVA和包被抗原的紫外掃描圖譜如圖1所示，PBA（291 nm）起到生色團作用，導致包被抗原的特征吸收波長（288 nm）與OVA（277 nm）相比出現紅移現象，由此證明包被抗原偶聯成功。

2.2 包被抗原的篩選

2.2.1 包被抗原與抗體最佳工作濃度的測定

采用方陣滴定法[11]測定ELISA中包被抗原與抗體的最佳工作濃度。根據間接競爭ELISA檢測方法的要求，選擇OD450nm值在1.2～1.5之間且抗原、抗體用量較少的濃度，作為最佳工作濃度。經過測定，抗體最佳工作濃度為0.25 μg/mL，包被抗原最佳工作濃度見表1。

2.2.2 包被抗原與抗體的親和常數測定

Ka反映抗原與抗體結合力的大小。一般認為，當Ka值在107～1012L/mol范圍時，抗體親和力較高[16]。根據式（1）計算得親和常數，見表1。6種包被抗原與抗體的親和常數均大于107L/mol，表明這些人工抗原與抗體的結合能力較高。此外，用混合酸酐法制備的包被抗原與抗體的親和力更高；并且在試驗范圍（30∶1，45∶1和60∶1）內，反應比越大，親和力越高。結果如圖2所示。所選有機溶劑對抗原抗體的結合有顯著影響，根據體積分數的不同，存在促進或抑制結合不同的表現，其中甲醇的影響最小，與其他研究結果一致[11,17-18]，所以選擇甲醇作為標準品稀釋液中的輔助溶劑。

圖1 包被抗原紫外掃描圖譜

表2 交叉反應篩選最佳包被抗原

表1 包被抗原的最佳工作濃度與親和常數

2.2.3 交叉反應篩選最佳包被抗原

表2匯總了利用間接競爭ELISA方法初步測定11種擬除蟲菊酯的交叉反應結果，使用MA2包被時能夠識別8種擬除蟲菊酯，在所有包被抗原中數量最多且靈敏度最高。

綜合比較包被抗原的工作濃度、親和常數、交叉反應和靈敏度，結果發現偶聯方法和反應比對各指標有顯著影響。與EDC法相比，混合酸酐法制備的包被抗原用量少、與抗體結合能力更強，對擬除蟲菊酯的交叉反應更多，且靈敏度更高，而不同反應比得到的包被抗原指標也有差別。最終選擇MA2（混合酸酐法，反應比45∶1）作為最佳包被抗原進行進一步的方法建立。

2.3 間接競爭ELISA方法的條件優化

2.3.1 標準品稀釋液中有機溶劑種類及濃度的優化

擬除蟲菊酯類農藥在水中溶解度極小，但易溶于有機溶劑，所以需要選擇適當的有機溶劑輔助溶解。用不同有機溶劑配制標準品稀釋液，不添加菊酯標準品，考察常見有機溶劑對抗原抗體結合能力的影響，

圖2 有機溶劑對抗原抗體結合能力的影響

圖3 甲醇體積分數對間接競爭ELISA的影響

甲醇含量的影響如圖3所示。中低體積分數（10%～40%）甲醇對抑制曲線和靈敏度的影響較小，高體積分數（50%～60%）甲醇會降低菊酯的抑制效果。這可能是一定體積分數的甲醇促進了菊酯的溶解和分散，過多的甲醇則破壞了抗體的蛋白結構，影響其與抗原的結合[11]?？紤]到盡可能減少對反應體系的影響，甲醇添加量選擇10%。

2.3.2 抗體稀釋液中離子強度的優化

抗原-抗體的結合反應與二者作用時形成的鹽橋和氫鍵有關，離子強度（即緩沖液中鹽離子濃度）是一個重要的影響因素。離子強度對間接競爭ELISA的影響如圖4所示。當離子強度大于或等于20 mmol/L時，抗原與抗體之間沒有結合反應；當離子強度為5 mmol/L時，IC50急劇增大，靈敏度降低；而當離子強度為10 mmol/L時，抑制曲線的趨勢正常，且靈敏度較高。因此，抗體稀釋液的離子強度選擇10 mmol/L。

圖4 離子強度對間接競爭ELISA的影響

2.3.3 抗體稀釋液pH的優化

pH是影響抗原抗體結合反應的另一個重要因素，pH對間接競爭ELISA的影響如圖5所示。不同pH條件下ODmax的差異較大，表明pH對抗原抗體結合能力具有較大的影響；而ODmin的差異較小，表明在pH 6.0～9.5范圍內，菊酯的抑制效果相似。綜合考慮兩者的影響，選擇對抗原抗體結合作用影響最小的pH，即pH 7.4作為抗體稀釋液的pH。

圖5 pH對間接競爭ELISA的影響

2.4 甲氰菊酯標準抑制曲線

在優化條件下建立間接競爭ELISA檢測甲氰菊酯的標準抑制曲線，如圖6所示。其IC50為8.69 ng/mL，線性檢測范圍（IC20～IC80）為2.65～28.55 ng/mL，檢測限（IC10）為1.32 ng/mL。

2.5 間接競爭ELISA對擬除蟲菊酯交叉反應率的測定

11種擬除蟲菊酯以及半抗原的交叉反應結果如表3所示。建立的間接競爭ELISA方法對甲氰菊酯的靈敏度最高，對氯氰菊酯、苯醚氰菊酯、氟氯氰菊酯具有較強的交叉反應（CR＞10%），對高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氟氯苯菊酯和順式氰戊菊酯具有中等強度的交叉反應（1%＜CR＜10%），對氯菊酯、右旋苯醚菊酯、聯苯菊酯和PBA無交叉反應。

圖6 間接競爭ELISA檢測甲氰菊酯標準抑制曲線

表3 擬除蟲菊酯類農藥的交叉反應結果

3 結論

用EDC法和混合酸酐法按不同反應比合成包被抗原，通過工作濃度、親和常數、交叉反應和靈敏度等指標，篩選出以混合酸酐法制備，反應摩爾比45∶1的MA2為最佳包被抗原，用于檢測方法的建立。經過間接競爭ELISA試驗條件的優化，選擇離子強度10 mmol/L、pH 7.4、甲醇含量10%作為競爭反應的最佳條件。在此基礎上，建立了甲氰菊酯的標準抑制曲線，并測定11種擬除蟲菊酯及半抗原的交叉反應。結果顯示，該方法能同時檢測8種擬除蟲菊酯，靈敏度達8.69～344.97 ng/mL，能夠實現擬除蟲菊酯類農藥的多殘留檢測。該方法還需要針對實際樣品進行進一步的準確性評價。