透明質酸發酵液中還原糖含量的快速估測方法

宋磊，劉苗苗，郭燕風，王宜磊*

1. 菏澤學院農業與生物工程學院（菏澤 274000）；2. 山東丹紅制藥有限公司（菏澤 274000）

透明質酸（HA）是一種高分子酸性黏多糖，有獨特的流變學特性、黏彈性、保濕性及良好的生物相容性，被廣泛應用于食品、化妝品、醫學等領域[1-5]。微生物發酵法生產透明質酸周期短，環境友好，產量高，是目前最主要生產方法[6-9]。葡萄糖作為發酵生產的唯一碳源，除少量用于菌體代謝增殖外，主要作為底物用于透明質酸的合成，是對發酵過程控制及判定發酵終止時間的重要參數[10-11]。透明質酸發酵液中還原糖含量的測定多采用3, 5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[12-14]，方法操作繁瑣、耗時長、人為誤差大，不能實時監測發酵液中還原糖含量。但透明質酸發酵生產周期短，發酵液各參數變化速度快，尤其在發酵衰亡期，菌體自溶裂解后釋放大量透明質酸酶，使透明質酸快速降解，極大地影響透明質酸生產收率及后

續分離與純化。因此快速估測出透明質酸發酵液中還原糖含量對生產實踐有很重要的指導意義。查閱國內外相關文獻，發酵工業生產過程中還原糖含量的測定常采用傳統的手工滴定法或比色法[15]，鮮見有對發酵液中還原糖含量與其他發酵過程參數相偶聯，通過快速檢測其他過程參數而快速估測還原糖含量的相關報道。陳莉等[16]提出基于BP神經網絡快速估測發酵液中羊肚菌胞外多糖的含量，劉靜等[17]通過測定水溶液中濁度快速估測出水中殼聚糖含量，均取得有益的研究經驗。結合工廠生產實踐，通過對透明質酸發酵過程中發酵液中還原糖含量與其他幾個重要參數的相關性及變化規律分析，構建數學模型，以期能達到快速估測出發酵液中還原糖含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

發酵液（山東某生物工程公司）。

咔唑、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、3, 5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、四硼酸鈉、結晶酚（上海麥克林生化科技有限公司）；硫酸、氫氧化鈉（天津市永大化學試劑有限公司）；葡萄糖醛酸、葡萄糖標準品（國藥集團化學試劑有限公司）。

PL203/01電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；DV2TRV旋轉黏度計（美國博勒飛（廣州）有限公司）；WGZ-200濁度儀（上海昕瑞儀器儀表有限公司）；HK338電導率儀（北京華科儀科技有限公司）；UV5800分光光度計（上海元析儀器有限公司）；H1650離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；DZF6090真空干燥箱（上海皓莊儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵液取樣

透明質酸發酵周期短，發酵過程中各參數變化快。選定從發酵開始，間隔2 h取樣；取2019030901、2019031503、2019040201這3個發酵批次同一發酵時間節點發酵液，檢測其中還原糖含量、透明質酸含量、菌體量、濁度、黏度、電導率。

1.2.2 發酵液中菌體、透明質酸、還原糖含量變化曲線

對3個批次同一時間節點測得菌體、透明質酸、還原糖含量取平均值，繪制曲線。

1.2.3 還原糖含量與發酵液中各參數相關性分析

對3個批次同一時間節點測得還原糖含量、透明質酸含量、菌體量、濁度、黏度、電導率取平均值，繪制發酵液中還原糖含量與其他各參數相關性散點圖，并根據SPSS 19.0軟件分析結果，考察其相關性。

1.2.4 構建數學模型

篩選出與發酵液中還原糖含量變化規律相關顯著性參數，利用軟件構建一元線性、二次項曲線、BP神經網絡3種數學模型，用于預測未知發酵液中還原糖含量。

1.2.5 3種數學模型預測效果比較

對2019060401、2019060503兩個批次隨機13個發酵液樣品中還原糖含量及與其相關性顯著參數的含量進行測定；利用一元線性回歸、二次項曲線回歸分析及BP神經網絡3種數據處理方法獲得數學模型對發酵液中還原糖含量進行估測；將實測值與模型估測值進行對比，依據試驗樣本方差作為3種模型的評價指標，用于檢驗模型的準確性。方差計算如式（1）所示。

式中：S2為方差；Y1為數學模型計算值；Y2為試驗測得實測值。

1.2.6 發酵過程中各參數測定方法

發酵液中還原糖的測定參考文獻[12-14]。稱取6.3 g 3, 5-二硝基水楊酸（DNS）溶于少量蒸餾水中，加入262 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，加入185 g酒石酸鈉鉀、5 g結晶酚、5 g亞硫酸鈉，搖勻，冷卻后定容至1 000 mL棕色容量瓶中，于4 ℃冰箱中放置7 d備用。精密量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL 1.14 mg/mL無水葡萄糖對照品溶液于6個20 mL具塞試管中，補充蒸餾水至2 mL混勻，加入1.5 mL DNS試液，搖勻后置沸水浴保持5 min，冷卻至室溫，定容至mL，搖勻。同時，以水為空白管對照，采用分光光度計測定540 nm波長處的吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標，葡萄糖濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線。取透明質酸發酵液適當稀釋后，取1.0 mL溶液置20 mL具塞試管中，按照上述方法，自“補充蒸餾水至2 mL……”測定。根據標準曲線，計算供試品中還原糖含量。

透明質酸測定采用Bitter-Muir法[18-23]；發酵液黏度采用數顯旋轉黏度計測定，控溫度35 ℃，根據不同黏度，選擇合適轉子及轉速測定讀數；電導率采用電導率儀測定，控溫25 ℃測定；濁度測定，對發酵液稀釋10倍后，采用濁度儀測定；發酵液中還原糖測定[12-14]，采用3, 5-二硝基水楊酸（DNS）比色法；發酵液中菌體含量測定[24]，采取干重法，根據透明質酸發酵液黏度液稀釋一定倍數后離心取沉淀，洗滌1次，60 ℃真空干燥至恒質量，稱取質量計算細胞濃度。

1.3 數據處理

采用Excel 2010軟件進行數據統計及散點圖繪制；SPSS 19.0軟件用于相關性分析、偏相關分析、一元線性模型及二次項曲線模型構建；Matlab 2014軟件用于構建BP神經網絡模型；對3個批次發酵過程測得各參數取平均值用于相關性分析；3個批次各參數測得全部數據構建數學模型。

2 結果與分析

2.1 發酵液中菌體、透明質酸、還原糖含量變化曲線

對3個批次同一時間節點測得菌體量、透明質酸含量、還原糖含量取平均值，繪制曲線。結果如圖1和圖2所示。

從圖1可知，0～2 h為菌體生長的調整期，菌體量很少；2～10 h為對數生長期，菌體快速生長繁殖；10～18 h菌體進入穩定期，菌體量始終保持在高位；18 h后進入衰亡期，菌體開始自溶。從圖2可以看出，0～6 h透明質酸產量很少；6～16 h透明質酸快速積累；18 h后透明質酸開始降解，產量下降。還原糖含量2 h開始下降速度加快，主要用于菌體代謝繁殖及透明質酸前體合成；14 h菌體量趨于穩定，透明質酸前體大量合成，還原糖含量下降速度趨于平緩，18 h后還原糖含量趨于穩定。

2.2 還原糖含量與發酵液中各參數相關性分析

繪制散點圖，考察發酵液中還原糖含量與透明質酸含量、菌體量、濁度、黏度、電導率變化規律的相關性。結果如圖3所示。

由圖3可以直觀地看出，發酵液中還原糖含量與透明質酸含量、黏度相關性顯著，與菌體量存在一定相關性，與電導率、濁度相關性不顯著。采用SPSS軟件進行pearson相關檢驗分析，表1給出還原糖含量與透明質酸（HA）、菌體量、濁度、黏度、電導率各參數之間相關性系數。由表1可知，當顯著性水平p＜0.01時，發酵液中還原糖含量與發酵液濁度、電導率變化不存在相關性，與發酵液中透明質酸、菌體量、黏度變化呈顯著性相關。

圖1 菌體生長曲線

圖2 透明質酸、還原糖含量變化曲線

圖3 還原糖與各參數散點圖

單純利用相關系數來評價變量間的相關性還不夠準確，還需要在剔除其他相關因素影響的條件下計算變量間的偏相關系數[16]。經偏相關分析，結果見表2。控制黏度及透明質酸含量2個變量，還原糖含量與菌體量相關性系數為0.300，顯著性水平為0.433，遠大于0.05，表明兩者存在虛假性相關。控制其他2個變量，在顯著性水平p≤0.01時還原糖含量與透明質酸、黏度變化規律呈顯著性相關，相關系數分別為0.887和0.799。這是由于發酵液中葡萄糖除了少部分用于菌體生長繁殖外，絕大部分是作為底物用于合成透明質酸，其流程是葡萄糖經糖酵解（EMP）途徑形成6-磷酸果糖，在酶的作用下形成6-磷酸葡萄糖胺，6-磷酸葡萄糖胺經乙酰化后合成尿苷二磷酸-N-酰基-氨基葡萄糖；尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸通過糖醛酸途徑合成。透明質酸合成酶交替地將尿苷二磷酸-N-酰基-氨基葡萄糖和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸以每分鐘約100個糖單位的速度快速添加到HA分子鏈上，同時逐漸增長的HA鏈會穿過質膜被送到胞外基質中[10-11]。故發酵液中還原糖含量與透明質酸含量變化表現出較強的相關性。透明質酸水溶液由于其分子內和分子間的作用，具有非牛頓流體的流變學特性及黏彈性。透明質酸濃度較低，溶液的黏度隨濃度變化相對較小，但濃度達到某一閾值時，溶液的黏度隨濃度增加而快速提高，并表現出很強的相關性，因此發酵液中還原糖含量與黏度也表現出顯著的相關性。結合兩變量相關性及偏相關分析，發酵液黏度與發酵液中透明質酸均可預測發酵液中還原糖含量。考慮到發酵液黏度檢測可通過旋轉黏度計直接讀數，方法簡單；發酵液中透明質酸檢測步驟繁瑣、時間長、誤差大情況，選定發酵液黏度作為描述發酵液中還原糖含量變化的唯一變量。

表1 還原糖與各參數相關系數

表2 還原糖與各參數的偏相關系數

2.3 構建數學模型

取3個發酵批次33組試驗數據用于數學模型的構建，采用SPSS 19.0進行一元線性回歸和二項式曲線回歸分析；采用Matlab 2014構建BP神經網絡模型。式中Y代表發酵液中還原糖含量，X代表黏度。

2.3.1 一元線性回歸

對33組試驗數據進行一元線性回歸分析。Y=-0.380 3X+49.790 7。

經分析得，該線性方程復相關系數為0.993 2，判定系數R2=0.904 3，表明擬合效果較好；模型殘差進行獨立性檢驗DW=0.438 0，查詢Durbin Watson table可以發現DW值恰好出在無自相關性的值域之中，認定殘差獨立，通過檢驗；回歸方程顯著性檢驗的概率p=0.000＜0.01，表明由自變量黏度和因變量還原糖含量建立的線性關系回歸模型具有顯著的統計學意義。

2.3.2 二次項曲線回歸分析

二次項曲線回歸分析模型為Y=53.211 1-0.848 0X+0.003 648X2。

經分析得，回歸方程顯著性檢驗的F=122.268 2，判定系數R2=0.968 3，回歸方程顯著性檢驗的概率p=0.000，說明模型高度顯著。

2.3.3 BP神經網絡

BP神經網絡是一種按誤差反向傳播訓練的多層前饋網絡，具有很強的非線性映射能力，能很好地應用于非線性預測問題[25-27]。取33組試驗數據構建3層結構BP神經網絡[24-26]，輸入層、輸出層各一個神經元，分別代表發酵液黏度和發酵液中還原糖含量，輸入層到隱含層的傳遞函數為logsig函數，隱含層到輸出層之間選擇purline線性傳遞函數。網格訓練函數采用應用Levenberg-Marquardt優化后的trainlm訓練函數算法。經多次試錯法訓練，最佳隱含層神經元個數為5個，訓練后平均R值為0.997 43。

2.4 3種數學模型預測效果比較

對2019060401、2019060503其他2個批次13個試驗樣本進行發酵液黏度及還原糖含量檢測；依據發酵液黏度值利用一元線性回歸、二次項曲線回歸分析及BP神經網絡3種數據處理方法獲得數學模型對發酵液中還原糖含量進行估測；將實測值與模型估測值進行對比，試驗樣本方差作為3種模型的評價指標檢驗模型的準確性，結果如表3所示。

表3 3種模型檢驗結果

由表3可知，利用BP神經網絡模型的檢驗方差值最低，僅為0.169 4，算得標準差為0.411 5，表明利用BP神經網絡建立模型預測準確率較高，可用于發酵液中還原糖含量的快速估測，二次項曲線回歸分析模型與一元線性回歸模型的預測準確率較低。

3 結論

在透明質酸發酵工業中，實時了解發酵液中還原糖含量，對掌握發酵過程狀況、判定發酵終止時間、提前準備后續分離純化工作有很大的指導意義。通過對發酵液中還原糖含量與透明質酸、菌體量、濁度、黏度、電導率變化規律的相關及偏相關分析，發酵液黏度、透明質酸含量、還原糖含量3個參數相關性顯著。考慮到發酵液中透明質酸檢測方法復雜、時間長、誤差大等缺點，選擇發酵液黏度作為估測發酵液中還原糖含量的唯一參數。對構建一元線性回歸分析、二次項曲線回歸分析及BP神經網絡3種數據處理方法獲得的數學模型進行驗證分析，BP神經網絡預測效果最為準確，方差為0.169 4，可以很好地預測發酵液中還原糖含量。由于試驗樣本有限，取33組試驗數據，如能增大試驗樣本數量，利用BP神經網絡構建模型對試驗結果預測會更加精確。此外，黏度與透明質酸含量相關性非常顯著，利用黏度亦可預測發酵液中透明質酸含量。