天冬酰胺內肽酶敲除協同阿可拉定有效抑制乳腺癌骨轉移

包佳煜，陳峻崧，郭 方

在中國，癌癥的發生發展率正在不斷增加，每年被診斷出超過 1 600 萬人，并且有 1 200 萬人死于該疾病。與其他大多數國家一樣，乳腺癌現在是我國女性中最常見的癌癥。我國占全球所有新診斷乳腺癌的12.2%，占所有乳腺癌死亡人數的9.6%[1]。晚期乳腺癌易發生肋骨、胸骨、胸椎及腰椎等部位骨轉移，其發生率為65%～75%[2]。

天冬酰胺內肽酶(legumain，LGMN)是一種酸性半胱氨酸內肽酶,具有良好的保守性，在植物、無脊椎動物寄生蟲以及哺乳動物中均存在。它在腫瘤微環境中過表達，同時通過促進細胞遷徙和組織入侵等方式，促進癌細胞的轉移[3]。

阿可拉定是異戊二烯類黃酮衍生物，具有化學穩定性、易于獲得等特點。此外，阿可拉定在不同的癌細胞中表現出抗癌活性，包括肝癌[4]、乳腺癌[5]、結腸癌[6]等。近幾年，研究表明阿可拉定不僅具有抗癌活性，還可以抑制破骨細胞的體外活性，通過抑制骨吸收來發揮骨保護功能[7]。該研究旨在從動物水平探究LGMN的敲除和聯合用藥阿可拉定對乳腺癌骨轉移的療效，為未來腫瘤轉移等研究和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物與細胞株 SPF級Balb/C雌鼠，6周齡，由上海交通大學動物房飼養, 其中Balb/C背景的LGMN敲除鼠是由日本Masahide Asano課題組的C57背景敲除鼠與Balb/C小鼠回交約10代得到。細胞株：4T1.2細胞株為可定向骨轉移細胞株。

1.1.2主要的儀器與試劑 二氧化碳細胞培養箱、-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)；高速超低溫離心機(德國Beckman公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；GAPDH、β-actin(美國Proteintech公司); p-STAT3、STAT3(武漢博士德公司)；legumain(美國Abcam公司)；p-GSK3α/β、GSK3β、 β-catenin(美國CST公司)；Sodium Pyruvate、MEM NEAA(美國Sigma公司)；阿可拉定(上海融禾醫藥科技發展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 乳腺癌細胞株4T1.2用含10%胎牛血清的DMEM培養基(加入1%的Sodium Pyruvate和1%的MEM NEAA), 置37 ℃、5% CO2的培養箱中培養, 取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.2模型制備 應用左心室注射4T1.2細胞法進行造模 (活細胞懸液濃度為106個/ml, 每只注射0.1 ml) ，具體操作為將小鼠四肢用膠帶固定在加熱墊, 小鼠身體完全伸展開，保持在實驗過程中小鼠體溫相對恒定，用1 ml的胰島素注射器吸取細胞懸液，注射進小鼠的左心室，其位置是：距離中軸約3 mm，第二類間隙，進針角度與腹正中線夾角約為45°，進針長度約為7 mm，扎針成功的標志是鮮紅色的血液不斷往外蹦，保持扎針角度和位置不變，緩慢將細胞懸液緩慢推進左心室，當注射器拔出后，用棉球按壓左心室片刻，以防細胞漏于胸腔，造模約3周時間取材檢測，實驗分為空白對照組、模型組、用藥組，其中用0.5%羧甲基纖維素鈉作為空白對照組的灌胃劑，實驗組阿可拉定的濃度是5 mmol/L，每組15只，根據小鼠體質量灌胃(0.01 ml/g)，相關實驗均在SPF級動物房完成，并且符合動物倫理。

1.2.3模型檢測 Micro-CT是專用于小動物的計算機體層成像系統,反映骨標本的三維數據, 其中圖像和數據的處理軟件包括CTAn、CTvol等。將固定好的骨標本進行檢測，在分析之前使用DataViewer將分析區域骨骼的長軸作調整，使其與冠狀位及矢狀位的軸線保持平行。用CTAn軟件對骨的微觀結構進行相應參數分析，具體包括骨體積分數(percent bone volume，BV/TV)、骨小梁數量(trabecular number，Tb.N)、骨表面密度(bone surface density，BS/TV)、骨小梁分離度(trabecular separation，TB.sp)等。用CTvol進行CT掃描圖像三維演示。

1.2.4蛋白免疫印跡實驗 液氮研磨法將新鮮骨組織碾碎，將研磨好的組織用蛋白裂解液裂解(含PMSF 1 mmol/L和磷酸酶抑制劑)，13 200 r/min離心5 min, 取上清液，測定蛋白濃度，加入蛋白loading，100 ℃、煮10 min，使蛋白變性。Bio-Rad濕法電泳，10%聚丙烯酰胺凝膠進行分離蛋白，再100 V轉膜2 h。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；分別加入對應的一抗，其中β-actin稀釋比為1 ∶10 000；其余抗體均為1 ∶1 000，4 ℃孵育過夜。次日用TBST緩沖液漂洗3次，每次5 min;加入對應二抗1 ∶5 000，1 h，室溫TBST緩沖液漂洗3次，每次5 min；加入曝光液顯影，拍攝成像。

2 結果

2.1 小鼠鑒定與生存分析根據正常野生型小鼠和LGMN敲除型小鼠骨髓中蛋白表達條帶顯示，在野生型中存在蛋白表達，在敲除型小鼠中沒有蛋白表達，見圖1A。每組15只小鼠進行動物實驗，20 d為時間節點統一處理實驗小鼠，根據生存周期，繪制生存曲線。野生型的小鼠中位生存期低于LGMN敲除型的小鼠，同時敲除型聯合用藥組的小鼠生存周期長于單獨LGMN敲除型的小鼠，采用Log-rank (Mantel-Cox) 方法分析得出差異有統計學意義P<0.05。見圖1B。

圖1 小鼠LGMN表達與生存曲線圖

2.2 骨腐蝕情況檢測經Micro-CT的檢測結果顯示LGMN缺失的小鼠在造模后腐蝕情況較野生型的差異體現在松質骨，BV/TV數值上升(F=7.90，P<0.05)、TB.sp下降(F=9.59，P<0.05)；而在LGMN敲除的小鼠同時用阿可拉定進行治療，骨腐蝕的情況得到改善，Tb.N為(F=117.16，P<0.001)、BV/TV為(F=326.96，P<0.001)、TB.sp為(F=37.84，P<0.01)、BS/TV為(F=115.90，P<0.001)。見表1、圖2。

2.3 骨組織相關蛋白檢測蛋白免疫印跡實驗表明在造模組，β-catenin(F=15.79，P<0.05)、p-STAT3(F=16.72，P<0.05)、p-GSK3β(F=9.68，P<0.05)的表達量上升而在LGMN敲除的小鼠中對應蛋白的表達量下降，具有顯著性差異；在LGMN敲除和聯合用藥的情況下，蛋白的表達量進一步降低，β-catenin(F=28.10，P<0.01)、p-STAT3(F=107.56，P<0.001)、p-GSK3β(F=26.77，P<0.01)。見圖3。

表1 骨小梁結構參數

圖2 骨組織三維重構與分析圖

2.4 模型組和用藥組的臟器觀察通過對小鼠的脾臟觀察，模型組野生型和LGMN敲除型小鼠的脾臟不存在顯著性差異，但在LGMN敲除聯合用藥的情況下脾臟減小，差異有統計意義(F=73.50，P<0.01)。見圖4。

3 討論

眾所周知，轉移包括多重步驟，具體為腫瘤細胞首先從原發腫瘤部位脫落并遷移，侵入鄰近組織并穿透基底膜，進入血液或淋巴管，從而經過循環系統傳播至遠處的器官，形成微轉移性結節，然后在周圍的基質定植并且重塑，并形成轉移[8]。骨骼是實體瘤轉移的第3部位，在晚期乳腺癌中，骨轉移的發生率高，同時首發癥狀為骨轉移者占27%～50%[2]。其中轉移通常存在于富含紅骨髓和骨小梁的骨骼中，例如椎骨、肋骨、骨盆和長骨的末端，在手或腳的骨骼中很少。同時，骨痛、骨損傷、骨痛加劇等是乳腺癌骨轉移常見的并發癥，同時一旦發生骨轉移，預后相對較差。目前臨床上乳腺癌的治療方法，有通過FDA批準的單克隆抗體藥物地諾單抗、阿法替尼等[9]。但是療效仍然不盡人意，更有效的靶點和治療仍需要被探究。

圖3 小鼠骨組織的蛋白檢測與豐度統計

圖4 小鼠脾臟大小統計

研究[10-11]表明STAT3激活發生于40%以上的乳腺癌中，STAT3的抑制可以改善乳腺癌的進程，并且減少轉移，最終提高患者的整體生存率。在腫瘤炎癥微環境中，GSK3β磷酸化可影響WNT信號通路的下游因子是β-catenin[12]。相關研究[13]發現，與不發生骨轉移的TM40D乳腺癌細胞比較，高骨轉移的TM40D-MB乳腺癌細胞表現出更高的β-catenin的信號活性。

本研究表明，在LGMN敲除的小鼠中，骨腐蝕程度明顯減小；聯合用藥后顯示乳腺癌骨轉移的情況得到進一步改善。根據蛋白免疫印跡圖，聯合用藥后，改變了STAT3、GSK3β、β-catenin相關信號通路，治療組p-GSK3β和β-catenin均發生了下調，說明敲除LGMN聯合用藥降低了機體的促炎反應，從而緩解了乳腺癌的骨轉移。同時由于阿可拉定的骨保護作用，其遏制破骨細胞的形成，這可能也將對已經發生骨轉移的小鼠，在轉移灶處起一定的保護作用，進一步的減少骨的破壞[13]。

LGMN在腫瘤微環境中高度表達，具有作為生物標記物和治療靶標的潛力。研究[3]表明使用基于LGMN的DNA疫苗可以特異性靶向腫瘤微環境中的腫瘤相關巨噬細胞，該疫苗通過控制LGMN陽性的腫瘤相關巨噬細胞,參與調控CD8+的T細胞應答，有效地保護宿主免受腫瘤細胞的攻擊。本研究選擇用LGMN野生型和敲除型的小鼠進行實驗，觀察LGMN敲除的情況下可緩解小鼠乳腺癌骨轉移。

阿可拉定在藥理學中的研究表明，它具有廣泛的治療能力，存在巨大的醫用價值，它有效靶向癌癥干細胞和耐藥性癌細胞，以抗增殖、抗血管生成等方式參與調節[14]。阿可拉定在相關的研究中被發現可以有效抑制三陰性乳腺癌，同時通過影響相關信號通路誘導細胞凋亡，同時減少乳腺癌細胞中干樣細胞比例[5]。本研究表明使用藥物后可以略微緩解乳腺癌骨轉移。