HOTAIR在急性髓細胞性白血病中的表達及其對柔紅霉素耐藥的作用機制

陳玲琳，熊術道，高申孟

急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一組由染色體易位和(或)體細胞突變等多種遺傳異常引起的造血系統惡性腫瘤[1]。長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA，LncRNAs)是非編碼RNA的一種，是轉錄本長度大于200個核苷酸的非編碼RNAs[2]。HOX 轉錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)是第1個被發現具有反式作用的LncRNAs基因[3]。研究表明，HOTAIR表達水平上調不但與多種腫瘤包括乳腺癌[4]、宮頸癌[5]、AML[6]等的發生相關，還與腫瘤細胞的耐藥密切相關[7]。與柔紅霉素(daunorubicin,DNR)聯合用藥是AML化療的重要方案，研究[8]表明臨床上DNR耐藥情況遞增。因此，了解AML對DNR耐藥機制有助于改善疾病的治療。而有關HOTAIR與AML耐藥的相關研究未見報道。該研究選取U937和TPH1耐藥細胞株為研究對象，以shRNA作為病毒載體下調細胞中的HOTAIR表達，同時檢測AML細胞對DNR的耐藥，探討相關的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑AML細胞株(HL60、THP1、U937、KG1、Kasumi-1、NB4、HEL、Kasumi-3、U937、THP1)及293T細胞株為溫州醫科大學附屬第一醫院內科實驗室保種。AML患者來源的骨髓單個核細胞50例(AML原代細胞)、正常捐獻者骨髓單個核細胞10例均來源于2017年5月～2018年10月溫州醫科大學附屬第一醫院血液科，標本采集前通過溫州醫科大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準及患者知情同意。分型標準參照French-America-British(FAB)標準，明確診斷為AML。RPMI 1640培養液、DMEM培養液、青霉素鏈霉素溶液購自美國Gibco公司；PCR引物購自上海尼桑生物科技有限公司；Actin抗體與P-糖蛋白抗體購自美國Bio-Rad公司；qRT-PCR儀、RT-PCR試劑盒購自美國ThermoFisher公司；DNR購自美國MedChemExpress公司；流式AnnexinV/PI試劑購自美國Becton-Dickinson公司；流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；optiMEN、X-gene 9 購自瑞士羅氏公司；sh-NC載體、sh-HOTAIR載體購自美國Promega公司。

1.2 細胞培養293T細胞培養使用含10%胎牛血清DMEM培養基；U937細胞、THP1細胞使用含10%胎牛血清1640培養基；37 ℃、5% CO2條件下培養，每48 h換液、傳代1次。

1.3 病毒包被取470 μl optiMEN、30 μl X-gene 9、sh-NC載體、sh-HOTAIR載體以及輔助質粒Gap-pol和VSVG,共同轉入293T細胞，培養6 h后棄上清液，加入新鮮完全培養液。收集培養后48、72 h上清液。兩次上清液以2 000 r/min離心10 min，0.45 μm過濾器過濾，-80 ℃保存待用。

1.4 載體轉染U937與THP1細胞以5×105/ml濃度，0.5 ml鋪6孔板，分別加入 sh-NC、sh-HOTAIR病毒上清液3 ml，1 500 r/min離心2 h,37 ℃、5% CO2孵育48 h后，加入嘌呤霉素篩選7 d。

1.5 Western blot檢測P-糖蛋白載體轉染后細胞經計數取等量活細胞，離心棄上清加含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提蛋白，用BAC試劑盒進行蛋白定量，加5×蛋白上樣緩沖液混勻變性。10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質140 V×40 min，電泳后轉移到聚偏二氟乙烯膜220 mA×1.5 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗后各自孵育P-糖蛋白(1 ∶2 000)與Actin(1 ∶5 000)抗體4 ℃過夜。棄一抗，TBST清洗3次，室溫孵相應HRP-標記的相應二抗1 h，TBST清洗3次，加ECL試劑并上機顯影。

1.6 qRT-PCR檢測HOTAIR的表達標本用TRIzol提取總RNA，經過逆轉錄得到相應cDNA，以GAPDH(上游引物：5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’，下游引物：5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’)為內參，40個循環qRT-PCR對其中的HOTAIR(上游引物：5’-AAAAGAGAGGGGTGGGAAGG-3’，下游引物：5’-CCGGAAATCAGGGCAGAATG-3’)的表達進行檢測，上述引物由上海尼桑生物科技有限公司設計合成。計算2-ΔΔCt值分析結果。

1.7 細胞增殖抑制實驗將轉染后細胞接種于96孔板,密度為104個/孔，體積為100 μl。每孔的DNR終濃度為0.1 μmol/L,重復3孔，37 ℃、5% CO2培養24 h后，每孔加10 μl CCK-8試劑，避光孵育2 h，450 nm檢測各組吸光度。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡將轉染后的細胞接種于6孔板中，加DNR終濃度為0.1 μmol/L為實驗組,不加藥組對照組，每株細胞重復3孔。37 ℃、5% CO2培養24 h后，加試劑避光孵育后檢測。

2 結果

2.1 HOTAIR在AML標本及細胞株中表達選取AML細胞系、AML患者骨髓單個核細胞、正常捐獻者骨髓。提RNA，逆轉錄，qRT-PCR檢測HOTAIR的表達。實驗結果表明，與對照組(10.70±2.85)比較，AML細胞系HOTAIR(30.50±8.39)表達上調，差異有統計學意義；與對照組(10.77±3.20)比較，AML原代細胞HOTAIR的表達(43.60±6.39)上調，差異有統計學意義。見圖1。

圖1 HOTAIR在不同細胞中的表達

2.2 DNR對AML細胞增殖影響終濃度為0.1 μmol/L的DNR處理24 h后,sh-HOTAIR+THP1組比sh-NC+THP1組增殖顯著下降(t=37.25，P<0.001)，sh-HOTAIR+U937組比sh-NC+U937組增殖顯著下降(t=29.47，P<0.001)(圖2)，提示在相同的藥物濃度下，sh-HOTAIR組增殖低，HOTAIR表達與藥物敏感相關。

圖2 DNR對不同細胞增殖的影響

圖3 沉默HOTAIR促進DNR對AML細胞凋亡

2.3 DNR對AML細胞凋亡影響轉染好的細胞分兩組，不加藥為對照組，另一組加終濃度0.1 μmol/L DNR組。 THP1細胞，DNR+sh-NC組細胞凋亡率高于對照sh-NC組(t=18.77,P<0.001)，DNR+sh-HOTAIR組細胞凋亡率高于對照sh-HOTAIR組(t=30.77，P<0.001)，DNR+sh-HOTAIR組細胞凋亡率高于DNR+sh-NC組(t=10.75，P<0.05)；U937細胞，DNR+sh-NC組細胞凋亡率高于對照 sh-NC組(t=28.60，P<0.001)，DNR+sh-HOTAIR組細胞凋亡率高于對照sh-HOTAIR組(t=40.49，P<0.001)，DNR+sh-HOTAIR組細胞凋亡率高于DNR+sh-NC組(t=15.33，P<0.05)。見圖3。

2.4 干擾HOTAIR影響P-糖蛋白的表達HOTAIR在AML中表達上調，為研究其是否參與耐藥，本研究進一步沉默HOTAIR的表達(圖4)，與sh-NC+THP1組(56.30±0.15)比較，sh-HOTAIR+THP1組(23.88±0.34)HOTAIR表達顯著下調；與sh-NC+U937組(49.99±0.76)比較，sh-HOTAIR+U937組(25.81±0.25)HOTAIR表達顯著下調；觀察HOTAIR對耐藥蛋白P-糖蛋白表達的影響，Western blot結果表明，THP1細胞，與sh-NC組比較，sh-HOTAIR組P-糖蛋白表達明顯下降(t=87.21，P<0.001)；U937細胞，與sh-NC組比較，sh-HOTAIR組P-糖蛋白表達明顯下降(t=81.39，P<0.001)。提示P-糖蛋白表達與HOTAIR表達水平相關(圖5)。

3 討論

AML是常見的血液系統腫瘤，除了早幼粒細胞白血病(M3)外，其他類型的AML目前仍無法治愈[9]，其中復發、耐藥是AML重要死亡原因之一。DNR是AML化療方案中的重要藥物，然而，關于AML對DNR的耐藥機制，尚未完全闡明。本研究顯示HOTAIR在AML細胞表達明顯上調，沉默HOTAIR表達及聯合DNR不僅有利于抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，而且可明顯下調P-糖蛋白的表達。表明HOTAIR可能參與了AML的發生發展及耐藥形成。本研究結果可能為AML的發生發展機制及藥物靶向治療提供新的研究基礎及思路。

研究表明 HOTAIR在AML中異常表達且與腫瘤耐藥相關。本研究對原代AML細胞及其相關細胞株的研究顯示HOTAIR在AML細胞表達明顯上調，與Wu et al[10]研究相似。

HOTAIR參與腫瘤耐藥研究得到越來越多的關注。Cheng et al[11]研究表明沉默HOTAIR胃癌細胞對順鉑的半數抑制濃度顯著下降。Yang et al[12]研究表明HOTAIR在非小細胞肺癌中表達上調并促進細胞對克唑替尼的耐藥。抑制HOTAIR的表達促進慢性粒細胞白血病細胞對伊馬替尼的敏感[7]，上述研究表明HOTAIR可能對細胞耐藥起著關鍵作用。本研究顯示，在終濃度為0.1 μmol/L的DNR作用下，敲低HOTAIR表達，可以抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。表明敲低LncRNAs HOTAIR可有效提高THP1與U937細胞對DNR的藥物敏感性，提示HOTAIR可能參與了AML耐藥。

人P-糖蛋白存在于正常組織胃腸道、肝臟和腎臟上皮細胞以及大腦的毛細血管、睪丸和卵巢中，P-糖蛋白充當了大腦、睪丸和卵巢的屏障，促進各器官排泄功能。P-糖蛋白由耐藥基因MDR1編碼，定位于細胞膜上，是ATP結合盒式(ATP bindingcassette，ABC)膜轉運蛋白超家族的成員，通過ATP釋放能量將細胞內的藥物泵出，降低胞內的藥物濃度[13]。Kong et al[14]研究表明，上調肝癌細胞中HOTAIR表達，細胞的P-糖蛋白表達上升，誘導了肝癌細胞對藥物耐藥。本研究結果表明，沉默THP1與U937細胞中HOTAIR表達，細胞P-糖蛋白表達也相應下降；P-糖蛋白對DNR外排作用降低，致使細胞增殖下降。同樣，在終濃度為0.1 μmol/L的DNR作用下，敲低HOTAIR的表達，P-糖蛋白表達下降，DNR被泵出細胞的量減少，滯留細胞內的時間延長，對白血病細胞的作用增強，可以促進白血病細胞凋亡[15]。因此，下調HOTAIR表達并協同DNR作用，進而促進細胞凋亡、抑制細胞增殖。

綜上所述，本研究表明HOTAIR在AML中表達上調，抑制HOTAIR表達，可以下調P-糖蛋白的表達，促進AML耐藥細胞株對DNR的敏感性，進而抑制AML細胞增殖，促進其發生凋亡。HOTAIR表達異常，參與了AML對DNR耐藥作用及其機制，研究結果為AML對DNR耐藥干預提供了新的潛在靶點。