電針預處理對小鼠腦缺血后谷氨酸轉運體2的影響

朱芳蕓, 張霞婧, 馮 燕, 翟 茜,邵勇平, 王 強

大腦是人體最為敏感的器官，發生腦缺血時，缺血時間越長腦組織損害越大，釋放的興奮性氨基酸谷氨酸越多，繼而過度激活與之相結合的突觸后膜受體N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartic acid，NMDA)，引起鈣離子超載，導致神經元凋亡或者壞死，由于體內缺乏谷氨酸降解酶，因此谷氨酸的轉運主要靠細胞膜上的谷氨酸轉運系統(Excitatory amino acid transporters, EAATs)，谷氨酸轉運體中EAAT2完成谷氨酸轉運的90%，因此EAAT2是最重要的谷氨酸轉運體[1]。大鼠腦缺血前給予電針(electroacupuncture，EA)刺激即預處理可產生腦保護作用[2]，該研究采用結扎小鼠雙側頸總動脈(Bilateral common carotid artery occlusion ,BCCAO)完成全腦缺血損傷模型，旨在探討電針預處理腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康清潔級雄性C57BL/6小鼠32只，12周齡，體質量18～23 g，購于西安交通大學醫學部動物實驗中心，飼養于通風良好，室溫(23±2)℃，濕度(50±5)%，自然光照，自由進食飲水。隨機數表分4組(n=8)：全腦缺血再灌注(BCCAO)組、電針預處理(EA+BCCAO)組、EAAT2抑制劑二氫卡因酸鹽(DHK)+EA+BCCAO組、EAAT2激動劑頭孢曲松鈉(CXT)+BCCAO組。所有動物均遵循“NIH實驗用動物管理和使用指南”，盡量減少實驗動物數量和動物所受的痛苦，以及善待動物等。

1.2 方法

1.2.1實驗動物處理 BCCAO組結扎動脈20 min；EA+BCCAO組麻醉后G6805-Ⅱ電針儀(青島鑫升實業有限公司)電刺“百會穴”，參數：電流強度1 mA，頻率2/15 Hz，疏密波，30 min/次/d，持續5 d，預處理后24 h結扎動脈20 min；DHK+EA+BCCAO組同EA+BCCAO組，結扎動脈前1 h注射DHK(批號：26All 12592，Tocris Bioscience公司，美國)200 μg/kg于側腦室給藥[3]，末次處理24 h結扎動脈20 min；CXT+BCCAO組腹腔注射CXT(批號：SHl455，上海羅氏有限責任公司) 600 mg/kg，1次/d，連續5 d。

1.2.2全腦缺血再灌注損傷模型制備 預處理后24 h結扎小鼠雙側頸總動脈完成全腦缺血再灌注損傷模型[3]。將動物以InterMed AV600s麻醉機(Penlon公司，英國) 3%異氟醚吸入麻醉后，繼續經異氟醚維持麻醉，保持自主呼吸，仰臥位固定動物，在頸正中部位顯露游離并結扎雙側頸總動脈20 min。缺血成功的標準：嘴唇發紺和呼吸急促，眼球蒼白和瞳孔散大；松開結扎線進行再灌注，再灌注成功的標準：瞳孔縮小，嘴唇紅潤，呼吸頻率規律。

1.2.3神經行為學評分和海馬CA1區凋亡神經元觀察 再灌注24 h，按運動功能評分(total motor scores，TMS)[4]進行神經功能觀察,由不清楚分組的一員執行。評分后，深麻醉暴露心臟，經升主動脈持續灌注肝素鈉和4%多聚甲醛各20 ml，斷頭取腦組織，制備石蠟切片，進行HE染色，BX51多功能熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)觀察，隨機選取5個視野，統計CA1區凋亡神經元數取平均值，凋亡神經元指：外形塌陷呈多角形或三角形，胞核溶解或固縮，胞漿嗜伊紅染色。每個小鼠取3張切片，取均值。

1.2.4Western blot法 斷頭取海馬腦組織，KeyGEN全蛋白提取試劑盒提取蛋白，并蛋白定量。30 μg總蛋白經10% SDS-PAGE 200 V 2 h分離，Bio-Rad電泳儀將蛋白轉到PVDF膜上，放入5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，滴加兔源性β-tubulin(1 ∶5 000，康為世紀生物科技公司，北京)和兔源性EAAT2(1 ∶1 000，Abcam公司，英國)4 ℃孵育24 h，使用洗膜緩沖液漂洗，滴入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(1 ∶1 000，科昊生物，西安)室溫孵育1 h，洗膜緩沖液漂洗，最后將PVDF膜放入ECL化學發光液，采用Bio-Rad掃描和發光。EAAT2的蛋白表達量：目的蛋白灰度值與內參β-tubulin灰度值的比值來表示。

1.2.5免疫熒光雙標染色 先暴露心臟，經升主動脈，0.9%肝素鈉生理鹽水20 ml持續灌注，然后4%多聚甲醛緩沖液20 ml繼續并行腦組織固定，后斷頭分離含有海馬的腦組織浸入4%多聚甲醛緩沖液4 ℃固定，然后先在20%的蔗糖，再用30%蔗糖繼續脫水。以10 μm厚度為冠狀切片切腦片。切片晾干，洗滌后使用兔源性GFAP(1 ∶600，Abcam，英國)和豚鼠源性GLT-1(1 ∶200，Millipore，美國)混合液4 ℃孵育36 h，再次洗滌后加入山羊抗兔Cy3(1 ∶200，Abcam，英國)和抗豚鼠FITC(1 ∶200，Abcam，英國)室溫避光孵育1 h。最后甘油密封熒光顯微鏡下觀察 。

2 結果

2.1 電針預處理對全腦缺血再灌注小鼠行為的影響與BCCAO組(3.0±0.5)分比較，EA+BCCAO組(7.1±0.3)分和CXT+BCCAO組(6.7±0.8)分行為學評分增加(t=11.77與t=10.25，P<0.05)；與EA+BCCAO組比較，DHK+EA+BCCAO組(2.3±0.3)分行為學評分降低(t=14.45，P<0.05)。

2.2 電針預處理對全腦缺血-再灌注小鼠海馬CA1區凋亡神經元的影響與BCCAO組(36.1±3.0)個比較，EA+BCCAO組(15.2±2.0)個和CXT+BCCAO組(12.5±2.0)個凋亡神經元數目減少(t=19.96，t=24.31，P<0.05)；與EA+BCCAO組比較，DHK+EA+BCCAO組(38.0±1.0)個凋亡神經元數目增加(t=18.22，P<0.05)。見圖1。

圖1 小鼠海馬CA1區凋亡神經元數目變化 ×400

2.3 電針預處理對全腦缺血-再灌注小鼠海馬CA1區EAAT2表達的影響Western blot結果：與BCCAO組比較，EA+BCCAO組和CXT+BCCAO組EAAT2蛋白表達增加(t=7.028，t=4.243，P<0.05)；與EA+BCCAO組比較，DHK+EA+BCCAO組EAAT2蛋白表達降低(t=4.692，P<0.05)。見圖2A。免疫熒光雙標染色結果：BCCAO組EAAT2蛋白表達較少，EA+BCCAO組和CXT+BCCAO組EAAT2表達增加，而DHK+EA+BCCAO組EAAT2表達減少。GFAP在EA+BCCAO和CXT+BCCAO組蛋白表達增加。EAAT2-GFAP熒光染色在EA+BCCAO和CXT+BCCAO組增強，說明兩者蛋白表達增加。見圖2B。

圖2 Western blot和免疫熒光雙標染色檢測EAAT2的蛋白表達情況

3 討論

腦卒中是發展中國家導致人群死亡的第二因素，我國卒中每年新增200多萬例，但目前對其預防沒有特別有效的措施[5]。C57BL/6小鼠因Willis環先天發育不全，因此可結扎雙側頸總動脈制備全腦缺血再灌注損傷模擬人類腦卒中[6]。使用電針刺激特異性穴位“百會穴”可以產生大鼠“腦缺血耐受”作用[7]。當腦部受到傷害或發生缺血損傷時，過量的谷氨酸積聚會導致神經元凋亡和壞死，而胞膜上的谷氨酸轉運體EAAT包括5型，其中星形膠質細胞上的EAAT2更為重要，在腦損傷時EAAT2主動轉運谷氨酸到胞內，進一步被谷氨酰胺合成酶降解為無神經毒性的谷氨酰胺[8-10]。實驗發現小鼠腦缺血前給予電針預處理，與BCCAO組比較神經行為學評分增加和海馬CA1區凋亡神經元數目減少。說明電針預處理可以減輕小鼠腦缺血損傷作用，產生腦保護作用。EAAT2拮抗劑DHK，因不能透過血腦屏障，選擇側腦室給藥[3]。末次電針預處理結束，側腦室給予DHK，給藥1 h后制作腦缺血再灌注損傷模型，結果發現DHK可以逆轉電針預處理的腦保護作用。CXT是EAAT2的特異性激動劑，連續腹腔注射可上調谷氨酸轉運體數目，起到腦缺血保護效果，本研究采用CXT腹腔注射預處理，結果發現神經行為學評分明顯提高和CA1區凋亡神經元數目降低，這與電針預處理產生作用相似[11]，提示EAAT2參與電針預處理產生腦缺血耐受作用。

Western blot結果顯示小鼠全腦缺血再灌注損傷組EAAT2蛋白表達上調，說明腦缺血損傷激活了谷氨酸轉運體，而電針預處理提高EAAT2的蛋白表達水平。EAAT2不僅分布于皮層，而且海馬也非常豐富，因此免疫熒光染色雙標選擇GFAP和EAAT2，結果顯示EA+BCCAO組EAAT2表達明顯增強，GFAP蛋白表達也明顯多于BCCAO組，雙標定位EAAT2-GFAP細胞數目明顯比BCCAO組增加，結論電針預處理的腦保護作用通過上調星形膠質細胞膜上的EAAT2來實現的。

綜上所述，小鼠腦缺血前給予電針刺激產生的腦保護是通過上調星形膠質細胞上的EAAT2來實現的，這也為臨床使用電針刺激儀預防和治療腦卒中奠定了一定的理論基礎。但這一技術如何應用于臨床還有待繼續研究。