miR-664b-5p對食管癌細胞EC9706和TE-1生物學行為的影響

向 輝，唐 明，李 陽，林怡秀，鄭 勇，陳衛剛

食管癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，90%的病例為食管鱗狀細胞癌[1]。食管癌的發病有著明顯的地域分布特征，其中位于新疆北部的哈薩克自治州新源縣和托里縣食管癌的發病率為90/100 000和155.9/100 000，遠高于全國平均水平(14.95/100 000)和新疆漢族人群(13/100 000)[2]。食管癌早期癥狀不典型，侵襲和轉移前多無癥狀，5年生存率低于20%[3]，目前食管癌的發病機制尚不明確。microRNAs(miRNAs)是一類大小約為23個核苷酸的非編碼RNA，有研究表明miRNAs的異常表達在食管鱗癌中發揮重要作用，如miR-21[4]、miR-375[5]、miR-34a[6]等。課題組前期[7]運用miRNA基因芯片技術發現，與癌旁正常組織比較，miR-664b-5p在哈薩克族食管鱗癌組織中高表達，qRT-PCR驗證結果與芯片一致。目前尚不清楚miR-664b-5p在食管鱗癌中發揮的功能。該研究在食管鱗癌細胞EC9706和TE-1中過表達和下調miR-664b-5p，觀察食管鱗癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲生物學行為的變化。

1 材料與方法

1.1 材料人食管鱗癌細胞株EC9706和TE-1由石河子大學醫學院新疆地方與民族高發病重點實驗室留存；胎牛血清購于以色列BI公司；DMEM培養基購于美國Gibco公司；miR-664b-5p模擬物和抑制劑及相應的陰性對照均購于廣州銳博公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購于美國Invitrogen公司；RNA抽提試劑Trizol試劑購于美國賽默飛公司，miR-664b-5p和內參U6引物、反轉錄試劑盒、miRNA qRT-PCR試劑盒購于德國QIAGEN公司，細胞增殖檢測CCK-8試劑盒購于日本東仁公司；兔抗人Bcl-2、兔抗人Bax抗體購于英國Abcam公司；小鼠抗人β-actin抗體、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗購于北京中杉金橋公司。

1.2 細胞培養與轉染用含有10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養基培養細胞，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。轉染前1 d，接種(3.0～5.0)×105個細胞/孔至6孔板，加入含10%胎牛血清不含抗生素的DMEM新鮮培養基，當細胞密度融合至50%～70%時，應用Lipofectamine 2000按照試劑說明書進行轉染。將細胞分為4組：轉染miR-664b-5p mimic組(miR-664b-5p模擬物)、miR-664b-5p mimic NC組(miR-664b-5p模擬物陰性對照)、miR-664b-5p inhibitor組(miR-664b-5p抑制劑)、miR-664b-5p inhibitor NC組(miR-664b-5p抑制劑陰性對照)。轉染12 h后更換為含有10%胎牛血清完全培養基繼續培養。

1.3 RNA的提取及qRT-PCR按照上述分組轉染后培養48 h，Trizol試劑提取細胞總RNA，參照試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA后qRT-PCR檢測miR-664b-5p的表達，以U6為內參。利用2-△△Ct方法計算miR-664b-5p的相對表達量。

1.4 CCK-8實驗將細胞(3 000個/孔)接種于96孔板，每孔體積100 μl，每組設置5個復孔。在37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養0、24、48、72、96 h時在每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續培養孵育2 h后用酶標儀測量各孔450 nm處的OD值。以時間點為橫軸，OD值為縱軸，繪制各組細胞生長曲線。

1.5 平板克隆形成實驗用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，按600個細胞/孔接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中，每2 d換液1次，培養14 d。當培養板中出現肉眼可見的克隆時，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色30 min。計數超過50個細胞的克隆數。

1.6 Transwell遷移和侵襲實驗用無血清培養基懸浮細胞并計數，調整濃度為2×105/ml。在下室加入800 μl含20%血清的培養基，上室加入150 μl細胞懸液，繼續在培養箱中培養24 h。用鑷子小心取出小室，吸干上室液體，4%多聚甲醛固定后結晶紫染色，用棉簽小心擦去上室底部膜表面上的細胞，用小刀切下小室底部膜，移至載玻片上中性樹膠封片，顯微鏡下隨機取5個視野記錄穿過膜的細胞數。侵襲實驗用無血清培養基按1 ∶7稀釋的基質膠，取70 μl鋪在上層小室，放入37 ℃培養箱中，孵育4 h，其余步驟同遷移實驗。

1.7 Western blot用含有苯甲磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，100 ℃變性5 min，10%分離膠進行蛋白電泳，半干轉法轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗(1 ∶1 000稀釋)，4 ℃搖床過夜，TBST洗膜后加入二抗(1 ∶10 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，洗膜后加入發光液后曝光。采用Image J軟件分析測定蛋白條帶的灰度值，同時檢測β-actin蛋白條帶作為內參，計算Bax和Bcl-2的相對表達量。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測轉染后miR-664b-5p的表達在食管癌細胞系EC9706和TE-1中分別轉染miR-664b-5p mimic、miR-664b-5p mimic NC或miR-664b-5p inhibitor、miR-664b-5p inhibitor NC，qRT-PCR檢測EC9706和TE-1細胞中各組miR-664b-5p的表達。結果顯示，EC9706和TE-1細胞中轉染miR-664b-5p mimic組miR-664b-5p的表達水平高于miR-664b-5p mimic NC組(t=9.782，P=0.001；t=9.925，P=0.001)(圖1A)，而與miR-664b-5p inhibitor NC組比較，轉染miR-664b-5p inhibitor組miR-664b-5p的表達減少(t=9.212，P=0.001；t=9.212，P=0.001) (圖1B)。

圖1 qRT-PCR檢測轉染后食管癌細胞中miR-664b-5p的表達

2.2 miR-664b-5p對食管癌細胞增殖的影響CCK-8結果分析顯示，各組OD值見表1。EC9706細胞轉染48 h后miR-664b-5p mimic組OD值開始低于陰性對照miR-664b-5p mimic NC組，差異有統計學意義(t=4.626，P=0.004)，96 h后miR-664b-5p mimic組增殖明顯抑制(t=14.086，P<0.001)(圖2A)。在TE-1細胞轉染24 h后miR-664b-5p mimic組OD值低于陰性對照miR-664b-5p mimic NC組，差異有統計學意義(t=2.991，P=0.024)(圖2B)。相反，EC9706細胞轉染miR-664b-5p inhibitor組24 h后OD值高于陰性對照miR-664b-5p inhibitor NC組 (t=12.486，P<0.001)(圖2C)。TE-1細胞miR-664b-5p inhibitor組同樣在24 h后OD值開始高于陰性對照miR-664b-5p inhibitor NC組(t=8.239，P<0.001)(圖2D)。

平板克隆形成實驗結果顯示，過表達miR-664b-5p后EC9706細胞miR-664b-5p mimic組克隆形成數(136.330±7.767)個低于對照組miR-664b-5p mimic NC組(293.330±20.207)個，差異有統計學意義(t=12.561，P<0.001)。TE-1細胞miR-664b-5p mimic組克隆形成數(253.670±15.275)個明顯低于對照組miR-664b-5p mimic NC組(568.000±13.115)個(t=27.042，P<0.001) (圖3A)。而抑制miR-664b-5p表達后EC9706細胞miR-664b-5p inhibitor組克隆形成數(279.000±25.942)個高于對照組miR-664b-5p inhibitor NC組(154.000±11.533)個(t=7.626，P=0.002)。TE-1細胞miR-664b-5p inhibitor組克隆形成數(460.670±18.339)個高于對照組miR-664b-5p inhibitor NC組(344.000±11.533)個(t=9.328，P=0.001)(圖3B)。

表1 miR-664b-5p對食管癌細胞EC9706和TE-1增殖的影響

圖2 CCK-8檢測miR-664b-5p對食管癌細胞增殖的影響

圖3 平板克隆形成實驗檢測miR-664b-5p對食管癌細胞克隆形成的影響

2.3 miR-664b-5p對食管癌細胞遷移和侵襲的影響Transwell遷移實驗結果顯示， EC9706和TE-1細胞轉染miR-664b-5p mimic組穿過小室底部膜的細胞數分別為 (81.000±15.716)和(126.333±18.339)個，少于相對應miR-664b-5p mimic NC組細胞數(187.667±37.873)和(298.333±41.633)個，差異有統計學意義(t=4.506，P=0.011；t=6.548，P=0.003) (圖4A)。Transwell侵襲實驗中EC9706和TE-1細胞轉染miR-664b-5p mimic組穿過小室基底膜的細胞數分別為(153.333±48.232)和(229.000±17.692)個，少于相對應miR-664b-5p mimic NC組細胞數(297.000±24.062)和(540.333±69.644)個，差異有統計學意義(t=4.617，P=0.010；t=7.504，P=0.002) (圖4B)，miR-664b-5p mimic NC組顯示出更高的遷移和侵襲能力。相反，抑制miR-664b-5p的表達后EC9706和TE-1細胞miR-664b-5p inhibitor組穿過小室底部膜遷移細胞數分別為(108.333±5.132)和(1 059.667±56.190)個，多于miR-664b-5p inhibitor NC組細胞數(64.000±12.288)和(100.667±8.082)個，差異有統計學意義(t=5.766，P=0.004；t=29.260，P<0.001) (圖4C)。Transwell侵襲實驗中EC9706和TE-1細胞轉染miR-664b-5p inhibitor組穿過小室基底膜的細胞數分別為(220.000±23.065)和(760.333±40.278)個，多于相對應miR-664b-5p inhibitor NC組細胞數(101.667±18.930)和(448.000±41.905)個，差異有統計學意義(t=6.869，P=0.002；t=9.307，P<0.001) (圖4D)，miR-664b-5p inhibitor組顯示出更高的遷移和侵襲能力。

2.4 miR-664b-5p對凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2表達的影響Western blot檢測細胞轉染miR-664b-5p mimic 48 h后促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，結果發現，與miR-664b-5p mimic NC組比較，EC9706和TE-1細胞中miR-664b-5p mimic組促凋亡蛋白Bax表達增加(t=7.748，P=0.016；t=15.119，P=0.004)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達減少(t=27.520，P<0.001；t=21.066，P=0.002)，差異有統計學意義(圖5A、B)。而EC9706和TE-1細胞中轉染miR-664b-5p inhibitor組與miR-664b-5p inhibitor NC組比較，促凋亡蛋白Bax表達減少(t=17.097，P<0.001；t=5.108，P=0.028)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達增加(t=19.400，P<0.001；t=15.633，P<0.001) (圖5C、D)。

圖4 Transwell實驗檢測miR-664b-5p對食管癌細胞遷移和侵襲的影響 結晶紫染色×100

圖5 Western Blot檢測miR-664b-5p對食管癌細胞中Bax和Bcl-2的表達的影響

3 討論

miRNAs的異常表達與食管鱗癌的發生發展密切相關，參與調節食管鱗癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學行為[8]。因此，全面地了解食管鱗癌相關的miRNAs，對疾病的預防、診斷和治療都十分重要。miR-664b-5p位于X染色體，包含24個核苷酸，由miRNA前體has-mir-664b的5’端臂加工而成。李彥樺 等[9]同樣運用miRNA芯片在3例漢族食管鱗癌患者中也發現，相比癌旁正常組織，miR-664b-5p在食管癌組織中表達上調，差異倍數為3.73，這與本課題組前期研究結果相一致，但哈薩克族患者中差異倍數更大，提示miR-664b-5p在食管鱗癌的發生發展中可能發揮重要作用。因此進一步在體外實驗中研究miR-664b-5p對食管癌細胞的生物學行為的影響。

本研究同時在EC9706和TE-1兩株食管癌細胞系中轉染miR-664b-5p模擬物或抑制劑，運用qRT-PCR檢測轉染后miR-664b-5p的表達水平，確定最優轉染條件滿足后續功能研究。無限增殖、逃避凋亡以及侵襲和轉移是腫瘤的重要特征，過表達miR-664b-5p后兩株食管細胞的增殖、侵襲和遷移能力降低。相反，下調miR-664b-5p兩株食管細胞的增殖、侵襲和遷移能力明顯高于陰性對照組。Western Blot結果發現，過表達miR-664b-5p后兩株食管癌細胞內促凋亡蛋白Bax表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，而抑制miR-664b-5p的表達后食管癌細胞中Bax表達降低，Bcl-2表達升高，提示過表達miR-664b-5p后細胞對死亡信號敏感，促進細胞發生凋亡。綜合以上結果表明miR-664b-5p能抑制食管癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并且促進細胞凋亡，在食管癌中發揮類似抑癌基因的作用。Song et al[10]研究發現過表達miR-664b-5p后降低了乳腺癌1號基因(BRCA1)突變的三陰性乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，誘導細胞凋亡，而抑制miR-664b-5p的表達則出現相反的結果，這與本研究結果相一致。進一步研究發現，細胞周期蛋白E2(CCNE2)為miR-664b-5p的下游靶基因[10]。

CCNE2在肺癌[11]、乳腺癌[10]等多種腫瘤中表達增加。在G1期/S期CCNE2與細胞周期蛋白依賴激酶2(CDK2)形成復合物磷酸化Rb，使轉錄因子E2F從磷酸化的Rb蛋白上分離，游離的E2F可促進DNA合成，推動細胞周期從G1期進入S期[12]。miR-664b-5p可與CCNE2 mRNA的3’端非翻譯區結合降解CCNE2 mRNA，抑制CCNE2蛋白的表達，阻止細胞周期進程由G1期轉換到S期，從而發揮抑制腫瘤的作用[10]。由此推測，食管鱗癌中miR-664b-5p可能通過抑制CCNE2的表達從而發揮抑癌作用。而miR-664b-5p也可能通過多個靶基因發揮抑癌作用，后期可進一步利用生物信息學分析miR-664b-5p的下游靶基因并通過熒光素酶報告實驗驗證結合位點，通過體內體外實驗證明其介導miR-664b-5p的抑癌作用。

目前普遍認為癌中高表達的基因常常發揮促癌作用，本研究發現在哈薩克族食管鱗癌中高表達的miR-664b-5p發揮著抑癌基因的作用。可能的原因如下：當細胞增殖異常加速分裂時，細胞反饋性增加了抑癌基因的表達，阻滯細胞周期進程，誘導細胞凋亡，故而可能表現為抑癌基因表達的升高。哈薩克族食管鱗癌中miR-664b-5p高表達的機制仍需進一步研究。

綜上所述，本研究在前期研究的基礎上，通過體外實驗研究表明miR-664b-5p抑制食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡，為闡明miR-664b-5p在哈薩克族食管鱗癌進展中的分子機制提供了研究基礎。