注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉靜脈沖擊治療Graves眼病對T細胞受體的影響

王 悅，劉宇峰，郭 輝，劉曉梅，伍麗萍，施秉銀

Graves眼病 (thyroid associated ophthalmopathy, TAO)是一種常見的自身免疫介導的炎癥性疾病，常見臨床表現有眼球突出、水腫、疼痛、活動障礙等[1]。TAO現有治療主要針對中重度活動期患者，給予大劑量注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉靜脈沖擊抑制免疫及炎癥反應，然而20%～30%的TAO患者對注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉沖擊治療無反應，10%～20%的患者在治療結束后復發[2]。激素具有廣泛的免疫及炎癥抑制作用，可減少淋巴細胞趨化作用，減輕受累組織炎癥反應[3-4]。該研究主要聚焦于TAO患者注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉沖擊前后T細胞受體(T cell receptor, TCR)的變化，進一步探索激素沖擊治療TAO的免疫學機制，為新興免疫學治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集西安交通大學第一附屬醫院門診就診的6例TAO患者，編號為LW003、LW004、LW005、LW006、LW008、LW009。于診斷時(T1)、第1次沖擊治療結束時(T2)、第3次沖擊治療結束時(T3)的3個時間點采集外周血。提取外周血單個核細胞并提取RNA進行TCR免疫組庫測序，然后進行后續高通量數據挖掘分析。TAO患者均接受注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉靜脈沖擊治療，注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉0.5 g/次，隔天1次，共3次為1個療程，每個療程間隔21 d，共3個療程。TAO的診斷依據是臨床表現、甲狀腺激素、促甲狀腺素受體抗體、甲狀腺B超及眼眶CT。排除標準包括合并其他自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤、1年內使用過其他免疫抑制劑。

1.2 TCR測序于診斷時、第1次沖擊治療結束時和第3次沖擊治療結束時的3個時間點采集空腹外周血10 ml。取新鮮抗凝血10 ml與等體積PBS液混勻，使用人淋巴細胞分離液提取單個核細胞，待樣品收齊后統一提取RNA，利用反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄成為cDNA。cDNA加入TCR VJ引物后，進行多重PCR(QIAGEN multiplex PCR Kit)。回收、純化后(QIAquick PCR Purification Kit)，進行末端修復反應，并純化，經過末端修復后的DNA片段在其3'端連上“A”堿基；接下進行接頭連接(Adapter oligo mix和DNA ligase)。PCR擴增后，進行電泳、膠純化回收(QIAquick PCR Purification Kit)，溶于Elution Buffer中，文庫構建完成。采用HiSeq 2000測序系統進行上機測序。

1.3 實時熒光定量PCR對T淋巴細胞共刺激分子及T淋巴細胞亞群(Th1、Th2、Th17和Treg細胞)進行mRNA水平上檢測(CD28、CD40、CTLA-4、PD1、TBX21、ATA-3、RORC和FOXP3基因)。提前根據各基因序列設計并合成引物，應用CFX96 Real-Time PCR 檢測儀 (Bio-Rad) and SYBR Premix Taq (Takara)進行實時定量PCR測定。PCR條件為：首次循環變性95 ℃、30 s，接著變性95 ℃、5 s，復性60 ℃、30 s，共40個循環。用一個cDNA倍比稀釋樣品進行標準曲線制作。

2 結果

2.1 TAO激素沖擊治療前后TCR多樣性變化使用Simpson指數和Shannon指數來表示TCR免疫組庫的多樣性。TAO患者在診斷時(T1)、第1次沖擊治療結束后(T2)和第3次沖擊治療結束后(T3)的多樣性指數進行組間兩兩差異分析，t檢驗結果(Simpson指數：P=0.67,P=0.84,P=0.56；Shannon指數：P=0.32,P=0.85,P=0.35)表明各組件差異無統計學差異(圖1)。

2.2 TAO激素沖擊治療前后TCR高頻VJ遷移在正常情況下，每個特定VJ家族構成的克隆群體占全部克隆的比例與該亞家族中氨基酸種類數目成正比。當疾病發生時，針對抗原的高親和力克隆(致病克隆)會有更高的擴增速率，并且遠遠大于整個家族擴增速率，即偏離正常的擴增斜率，向X軸傾斜(圖2A)。對TAO患者而言，淺藍、藍和黃色的實心圓分別代表診斷時、第1次沖擊治療結束后和第3次沖擊治療結束后的TCR免疫組庫。用灰色的實心圓掩蓋住了低頻VJ家族，圖2A代表TAO患者高頻TCR的克隆遷移。橫坐標表示VJ家族的頻率，縱坐標表示VJ家族中氨基酸種類的數目。坐標軸右下方代表的是頻率高，同時氨基酸種類少的VJ家族，提示該VJ家族最有可能是致病的家族。分析這部分VJ家族動態變化情況，結果發現在多次的檢測中這些家族始終存在，在各自當前狀態下其頻率還是占優勢(圖2B)。

圖1 TAO患者TCR多樣性指數變化情況

圖2 TAO激素沖擊治療前后TCR高頻VJ家族遷移

2.3 TAO激素沖擊治療前后TCR VJ家族頻率變化對這些患者隨訪結果顯示LW004和LW009沖擊3次后治療效果不理想，患者眼部癥狀無明顯改善，甚至有加重的趨勢。而剩下4例在3次治療結束后，突眼明顯改善，炎癥減輕。計算出這些患者TCR組庫在三個時間點的頻率，按照頻率從大到小排列，并制作出時間折線。隨著治療的進展，LW004和LW009高頻VJ家族，其頻率反而增加(圖3A)，而治療效果理想的4例患者，其高頻VJ家族沒有明顯的頻率變化(圖3B)。因此，我們推測致病的T淋巴細胞克隆隨著病程的變化不會發生消除，而是穩定的存在。同時，疾病的復發與這些T淋巴細胞克隆的擴增具有相關性。

圖3 TAO激素沖擊治療前后TCR VJ家族頻率變化A:治療效果不佳組；B:治療效果理想組

2.4 TAO激素沖擊治療前后TCR VJ家族中克隆變化將治療效果不佳的LW004和治療效果理想的LW003單獨挑出，繪制其高頻的兩個VJ家族V9-J1-6/V2-J1-4和V9-J1-6/V19-J1-3。圖4A可清晰的展示出V9-J1-6和V2-J1-4兩個家族中有兩個克隆，其頻率分別由24.06%和6.67%擴增至40.9%和15.76%。這兩個克隆的累積頻率已經大于該個體所有TCR組庫的50%。從圖4B可以看出，V9-J1-6和V19-J1-3兩個家族中的克隆始終穩定存在，并未消失。該結果可進一步說明致病的T淋巴細胞克隆隨著病程的變化穩定的存在。而疾病的復發與這些T淋巴細胞克隆的擴增高度相關。

圖4 TAO激素沖擊治療前后TCR VJ家族中克隆變化A: LW004治療效果不佳；B:LW003 治療效果理想

2.5 TAO激素沖擊治療前后T細胞亞群變化CD28和CD40是T細胞表面表達的刺激性共刺激分子，CTLA-4和PD-1是抑制性共刺激分子。TAO患者的這四種共刺激分子隨著病程變化組間差異無統計學意義(圖5)。當T淋巴細胞接受雙信號發生活化、增殖后，緊接著在細胞因子等影響下向不同的T亞群進行分化，這些亞群發揮完全不同的作用。Th1細胞介導細胞免疫應答，Th2細胞介導體液免疫應答，Th17細胞介導炎癥反應，而Treg細胞發揮免疫抑制作用，抑制其他效應T細胞的免疫反應。分別對Th1、Th2、Th17和Treg亞群的轉錄因子TBX21、GATA-3、RORC和FOXP3進行了檢測。結果表明TAO患者隨著病情的緩解，其RORC水平降低(P=0.039)(圖5)。該結果說明TAO患者病情緩解與Th17細胞減少有關。

圖5 TAO激素沖擊治療前后T細胞亞群變化與T1組比較：*P<0.05

3 討論

TAO激素治療后癥狀的緩解應該伴隨著免疫系統重新進入一種免疫耐受的狀態。但是到目前為止，緩解后的免疫基礎尚未完全闡明。有報道認為緩解伴隨著主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)分子降低、黏附分子或共刺激分子的改變[5-6]。有研究[7]表明已緩解的Graves病患者外周血中還存在針對TSHR的自身反應性T淋巴細胞，該研究結果被一種理論支持，該理論認為抗原特異性T淋巴細胞在失去特異性抗原刺激后，還可以保持若干年不改變[7]。近期又有兩項研究[8-9]，多發性硬化患者和強直性脊柱炎患者接受造血干細胞移植后對免疫狀態進行動態監測，結果表明，盡管經歷了大劑量化療和造血干細胞移植，患者體內依然存在大量致病性T淋巴細胞克隆。這也許說明自身免疫性疾病的緩解是通過免疫平衡的重新建立，而不是消除反應性克隆。本研究結果顯示TAO患者發病和緩解兩個階段TCR免疫組庫，無論從多樣性、克隆遷移還是克隆擴增和分布都沒有變化。因此，致病的T淋巴細胞克隆隨著病程的變化不會發生消除，而是穩定的存在。并且疾病的復發與這些T淋巴細胞克隆的擴增高度相關。

T淋巴細胞活化除了需要TCR/pMHC第一信號外，還需要共刺激分子傳遞的第二信號。當T淋巴細胞激活后進一步增殖、分化為不同的亞家族，發揮不同的作用[10-11]。為了進一步探索免疫恢復的機制，本研究對T細胞共刺激分子和T淋巴細胞亞群進行了檢測。結果表明盡管TAO患者TCR免疫組庫總體上在病程中沒有變化，但是Th17細胞下降。該結果再一次證實自身免疫性疾病緩解后的免疫耐受狀態是由免疫平衡的重新建立導致的，自身反應性克隆并沒有消除，這也很可能是自身免疫性疾病容易復發的原因之一。因此，在未來免疫治療的研發中應當考慮針對致病T淋巴細胞的靶向免疫抑制。