電子線照射對小鼠胰島素生長因子相關蛋白表達的影響

袁 慧，劉夢雅，許文黎，胡 波，張亞娟，尹晶晶，岳 娟，李建國

(中國輻射防護研究院藥物安全性評價中心，山西 太原 030006)

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)是一類結構與胰島素相似的多肽，主要包括IGF-1 和IGF-2 兩類多肽類生長因子，以及其相應受體IGF-1R、IGF-2R 和至少6 種胰島素樣生長因子結合蛋白(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP)。IGF 在各臟器中起著重要的代謝作用，控制各種細胞的增生、分化和凋亡進程。由于IGF 在人體生命活動中承擔著重要作用，所以電離輻射后它的表達變化顯得尤為重要[1-5]。前期本課題組已經得出輻射后IGF基因表達的變化情況[6-8]，本文將從蛋白水平上研究照射后小鼠體內胰島素生長因子表達的變化。

本實驗采用Western blot 方法檢測電子線照射小鼠后，小鼠肝臟中IGF1、IGF-1R、IGFBP1和IGFBP4蛋白的表達情況，為之后探討電離輻射對IGF 的影響及其機制提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級BALB/c 雄性小鼠100 只，25～30 g，由中國食品藥品檢定研究院生產，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2014-013；中國輻射防護研究院GLP中心動物實驗室飼養管理，實驗動物使用許可證號SYXK(晉)2013-0002。

1.2 輻照源

電子線采用直線加速器6 MeV 照射，Elekta Synergy，英國Elekta Limited 公司生產，山西白求恩醫院放療科提供，源皮距為100 cm，劑量率為3 Gy/min。

1.3 儀器

臺式離心機，德國Heraeus instrumennts 公司生產；電動勻漿機，CONNTROL公司生產；高速冷凍離心機，ThermoFisher Scientific 公司生產；電泳儀PowerPacTMBasic，BIO-RAD 公司生產；轉膜儀Tras-Blot， BIO-RAD 公 司 生 產； 程 控 金 屬 浴Inanbator Thermoelectric公司生產。

1.4 試劑

哺乳動物組織總蛋白提取試劑、小鼠anti-β-actin一抗、BCA蛋白質定量試劑盒、超敏ECL化學發光底物、過硫酸銨Ammonium Persulfate，均購自博士德生物工程有限公司；廣譜彩虹預染蛋白Marker購自康為世紀生物科技有限公司。

1.5 動物分組及照射

100 只雄性BALB/c 小鼠，隨機分為3 個不同劑量的電子線照射組(每組30 只)和1 個空白對照組(10 只)。照射組采用直線加速器全身照射小鼠，每次照射30只，照射劑量依據之前基因芯片篩選時的有效劑量設定，分別為1、2、4 Gy，劑量率為3 Gy/min。

1.6 Western blot檢測

1.6.1 總蛋白提取和濃度測定分別于照射后12、48、72 h將小鼠麻醉后摘取肝臟，置于預冷的生理鹽水中漂洗數次后，稱取100 mg，加入蛋白裂解液(含1 μL PMSF)，用超聲破碎儀進行組織勻漿。勻漿后靜置3 h，后離心取上清置于-20 ℃保存。按照BCA 法制備蛋白樣品，用酶標儀測定樣品的蛋白濃度。

1.6.2 進行SDS-PAGE電泳按比例配制12%的分離膠和8%的濃縮膠，加入濃度為5 μg/μL的蛋白樣品和標準品，采用恒壓的模式，電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處停止。

1.6.3 轉膜SDS-PAGE 結束后，按照標準的“三明治”方法將條帶轉移至PVDF 膜上，轉膜結束后，用TBST洗3次，采用濃度為5%的BSA封閉1 h，漂洗后放入一抗稀釋液孵育過夜。然后漂洗3 次，放入HRP標志的二抗稀釋液中，室溫孵育2 h。

1.6.4 顯影將配制好的超敏ECL 化學發光液與膜蛋白面充分接觸，將膠片進行掃描拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的相對分子質量和光密度值。

1.7 統計學分析

采用SPSS 17.0 進行數據分析，積分光密度比值以均數±標準差表示，組間差異采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 1 Gy 電子線照射后小鼠肝臟組織胰島素生長因子相關蛋白的表達情況

Western blot 檢測1 Gy 電子線照射后3 個時間點小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白的相對表達水平，結果采用檢測蛋白與內參蛋白β-actin積分光密度的比值表示，見圖1 和表1。與對照組比較，照射后3 個時間點，IGF-1 蛋白的積分光密度比值除了照射后48 h 時＞1，其余均＜1(均為P＜0.05)；IGFBP1、IGFBP4 和IGF1R 蛋白的表達情況相同，積分光密度比值均＜1(均為P＜0.05)。由此可以看出，1 Gy電子線照射后，小鼠肝臟組織中IGF-1蛋白在照射后48 h 時表達增加，IGFBP1、IGFBP4 和IGF1R 蛋白在照射后12、48和72 h時表達均減少。

2.2 2 Gy 電子線照射后小鼠肝臟組織胰島素生長因子相關蛋白表達情況

2 Gy 電子線照射后，Western blot 法檢測小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白的相對表達水平，結果見圖2和表2。與對照組比較，照射后3個時間點，IGF-1 蛋白和IGFBP4 蛋白的表達情況相同，與β-actin積分光密度的比值除了照射后48 h時＞1，其余均＜1(均為P＜0.05)；IGFBP1蛋白的積分光密度比值，在照射后12 h 時＞1，48、72 h 時＜1(P＜0.05)；IGF1R蛋白的積分光密度比值在各個時間點均＜1(均為P＜0.05)。由此可以看出，2 Gy電子線照射后，小鼠肝臟中IGF-1和IGFBP4蛋白在照射后48 h時表達增加，其余時間點為表達減少。IGFBP1蛋白在照射后12 h時表達增加，48和72 h時為表達減少。IGF1R蛋白在照射后3個時間點均呈現為表達減少。

圖1 Western blot檢測1 Gy電子線照射后不同時間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白表達情況

表1 1 Gy 電子線照射后不同時間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白相對表達水平比較

圖2 Western blot 檢測2 Gy 電子線照射后不同時間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白表達情況

表2 2 Gy 電子線照射后不同時間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白相對表達水平比較

2.3 4 Gy 電子線照射后小鼠肝臟組織胰島素生長因子相關蛋白表達情況

4 Gy 電子線照射后，Western blot 法檢測小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白的相對表達水平，結果見圖3 和表3。與對照組比較，IGF-1、IGFBP1和IGFBP4蛋白的表達情況相同，與β-actin 積分光密度的比值，在照射后的3個時間點均＜1(均為P＜0.05)；IGF1R 蛋白的積分光密度比值除了在照射后12 h 時＞1，48、72 h 時均＜1(均為P＜0.05)。由此可見，2 Gy電子線照射后，小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1和IGFBP4 蛋白均表達減少。IGF1R 蛋白在照射后12 h點為表達增加，48、72 h點均為表達減少。

圖3 Western blot 檢測4 Gy 電子線照射后不同時間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白表達情況

表3 4 Gy 電子線照射后不同時間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白相對表達水平比較

3 討 論

胰島素樣生長因子Ⅰ是多肽類生長因子，與其相應受體IGF-1R 結合可促進細胞分化、增殖等生物學過程，參與機體大部分促生長的代謝活動。因此生命活動的不同階段內，IGF-1 在機體的大部分組織中均有表達，但主要的合成器官仍是肝臟[9-11]。然而近年來研究發現IGF-1 與炎癥及肝纖維化進展有重要關系，在炎癥的刺激下，肝細胞超表達IGF-1，IGF-1 促使肝細胞增殖，加強肝臟的合成和代謝功能，從而促進炎癥的恢復[12-14]。但肝臟受到長期損害，能夠表達IGF-1 的肝細胞減少，故IGF-1 水平降低。因此，肝臟中IGF-1 的含量是肝臟功能好壞的指標之一。同時，由于肝臟是血液循環中IGF-1和IGFBPs的主要來源，肝臟受損時，IGF 系統會發生不同程度的改變，因此肝臟受損對IGF系統的影響也尤為重要。

本課題組前期利用基因芯片對60Co 射線照射的人肝細胞株進行輻射相關基因的篩選，發現胰島素生長因子家族中的基因差異表達顯著。因此選擇其為研究對象，對照射后人肝細胞株不同時間胰島素生長因子基因表達水平的改變進行了分析。本實驗從動物水平上觀察比較照射后不同時間小鼠肝臟中胰島素生長因子蛋白的表達情況。通過從照射后不同時間點的角度分析可看出：①電子射線照射劑量為1 Gy時，照射后3個時間點，小鼠肝臟中4種蛋白表達總體呈現為表達減少。其中僅IGF-1 蛋白在照射后48 h 時表達增加，IGFBP1、IGFBP4 和IGF1R 蛋 白 在 照 射 后12、48 和72 h均表達減少。②照射劑量為2 Gy時，照射后3個時間點IGF-1、IGFBP4和IGF1R蛋白表達趨勢總體為下調，其中IGF-1、IGFBP4 蛋白在照射后48 h 以及IGFBP1 蛋白在照射后12 h 表達增加，其余時間點均表達減少。IGF1R 蛋白在照射后3 個時間點均呈現為表達減少。③照射劑量為4 Gy 時，照射后3 個時間點，IGF-1、IGFBP1 和IGFBP4 蛋白的表達情況相同，均為表達減少；IGF1R蛋白除了在照射后12 h時表達增加，其余4 個時間點均為表達減少。對比發現照射劑量為2 Gy 時IGF-1、IGFBP1 和IGFBP4 蛋白均出現了表達增加，IGF1R蛋白在照射劑量達到4 Gy時出現了表達增加。此4 種蛋白表達的情況與小鼠肝臟中基因表達情況相同，進一步驗證了基因表達的結果，同時也表明電子輻射對胰島素生長因子體系的影響是錯綜復雜的，但總體表現為降低這4 種蛋白的表達。

上述4 種蛋白均屬于胰島素生長因子家族中的一員，其中IGF-1 通過與IGF1R 結合來調控各種細胞的增生、分化和凋亡進程，IGFBP1 與IGFBP4 主要用于運輸和調節IGF-1，控制IGF-1 運輸及代謝，調控IGF-1 定位于特定的組織及細胞上，決定IGF-1 的組織特異性[15-18]。肝細胞為4 種蛋白的主要分泌器官，TUNEL 法檢測到照射后6 h，小鼠肝臟細胞出現凋亡，從側面印證了蛋白的下調表達結果。同時肝細胞在受到放射損傷后會立即進入增殖修復的過程，IGFIR和IGF-1可以促進這一修復過程。而本實驗發現照射后IGF-1和IGF-1R蛋白表達下調，會影響到放射性損傷后肝組織的自我修復。

本研究利用Western blot 技術，采用電子線全身照射BALB/c 小鼠，觀察比較小鼠肝臟受到不同劑量照射及照射后不同時間點IGF-1R、IGFBP1、IGFBP4和IGF-1 蛋白表達水平的改變。結果表明，4 種基因和蛋白的表達水平基本上以下調表達趨勢為主，可為研究輻射對肝臟的早期損傷提供依據，其作用機制有待進一步探討。