甲基汞暴露致學習記憶功能障礙作用機制的研究進展

張 力，張愛華，王文娟*

(貴州醫科大學環境污染與疾病監控教育部重點實驗室/公共衛生學院，貴州 貴陽 550025)

汞(Hg)是一種有毒的重金屬元素，被世界衛生組織列為對公眾健康危害最大的10 種化學品之一。 甲基汞(methylmercury，MeHg)在所有汞化合物中毒性最強[1]。甲基汞主要是汞化合物在水體環境中通過微生物的轉化作用而自然產生的一種有毒化合物，其通過食物鏈傳遞，進行高度的生物富集[2]。由于甲基汞具有親脂性，易通過胎盤屏障，胎兒和新生兒極易受到甲基汞的毒性損害，因此，發育過程中的中樞神經系統(central nervous system，CNS)十分脆弱，是甲基汞毒性的主要靶點[3]。

甲基汞作為一種針對神經發育的毒性物質，其毒性機制和毒性效應一直引起人們的廣泛關注。震驚全球的日本水俁病事件揭示了長期暴露在高毒性的甲基汞環境中會導致機體感覺障礙、共濟失調等各種神經系統疾??；先天甲基汞中毒的胎兒可見廣泛的腦部病變且表現出腦癱和嚴重發育遲緩的癥狀[4]。

眾所周知，大腦的學習記憶是一個非常復雜的生理過程，目前甲基汞暴露對大腦學習記憶的影響及其機制尚不明確。本文就甲基汞早期暴露致學習記憶功能障礙的作用機制進行簡要綜述。

1 氧化應激

氧化應激會導致大鼠的學習記憶功能受損，被認為是甲基汞神經毒性的重要機制之一。谷胱甘肽系統在維持大腦的氧化平衡方面發揮著重要作用。研究發現[5]，宮內甲基汞暴露會破壞出生后仔鼠大腦中谷胱甘肽抗氧化系統的發育，導致谷胱甘肽(glutathione，GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性下降。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)在控制活性氧(reactive oxygen species，ROS)過度產生方面發揮著重要作用，Liu等[6]研究表明，甲基汞可致細胞內SOD的活性呈劑量依賴性下降。因此，甲基汞通過抑制細胞內抗氧化酶的活性，進而誘發ROS產生并作用于線粒體。

線粒體富含硫醇蛋白質，它不僅是甲基汞蓄積的主要場所，還是甲基汞毒性作用的靶向細胞器[7]。氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)是細胞內三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的主要來源，線粒體電子傳遞鏈酶復合體的活性降低會導致ATP合成障礙。甲基汞暴露可使線粒體中OXPHOS、電子傳遞鏈酶復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性下降，線粒體DNA過度損傷，導致ATP合成減少，誘發線粒體功能障礙，進一步促進ROS的生成，形成ROS過度生成的惡性循環，最終導致線粒體應激[8]。另外，在神經元細胞中，異常升高的ROS將會破壞胞內穩態，導致動力相關蛋白1激活、視神經萎縮癥蛋白1失活和線粒體碎片化，最終導致神經元細胞死亡，引起學習記憶功能障礙[9]。

總之，甲基汞暴露導致細胞內抗氧化酶的活性下降，誘發線粒體應激導致線粒體ATP合成功能障礙，ROS過度產生，誘發氧化應激，進而使神經元細胞數量減少導致大腦的學習記憶能力下降。

2 谷氨酸過度激活

谷氨酸作為興奮性神經遞質，介導中樞神經系統2/3 的突觸傳遞，在學習記憶、突觸可塑性以及大腦發育過程發揮著重要作用[10]，其受體分為離子型和代謝型。其中離子型谷氨酸受體又分為3種亞型：α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙氨酸(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid，AMPA)受體、N-甲基-d-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體和紅藻氨酸(kainic acid，KA)受體。

谷氨酸/天冬氨酸轉運蛋白(glutamate-aspartate transporter，GLAST)和谷氨酸轉運蛋白-1(glial glutamate transporter-1，GLT-1)是星形膠質細胞攝取谷氨酸的主要通道，負責調節細胞外的谷氨酸水平。神經細胞暴露于甲基汞后，由于產生過量的ROS而引起GLAST和GLT-1表達均明顯下降，由此導致谷氨酸在胞外大量蓄積，從而導致NMDA 受體的過度激活[11]。Beattie等[12]的實驗證明了NMDA 受體的激活可介導Ca2+內流而激活鈣調神經磷酸酶的活化從而誘發AMPA 受體內吞。AMPA 受體的內吞導致長時程抑制形成而導致突觸的數量減少，被認為是大腦遺忘的分子基礎。

高濃度的Ca2+會破壞鈣穩態，引發信號通路的紊亂，使神經型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)的活性增強、OXPHOS、線粒體活性失調和內質網應激等，從而導致細胞膜去極化和胞內細胞器功能紊亂[13]。一般認為，nNOS活性的增加會導致一氧化氮(nitric oxide，NO)生成增多，NO合成量的增加被認為是一些神經退行性病變神經元死亡的重要原因[14]。內流的Ca2+通過鈣調蛋白(calmodulin，CaM)激活nNOS 從而產生過量的NO，其可與·-O2形成具有強氧化毒性的過氧亞硝酸根，因此過量產生的NO最終會導致神經元細胞死亡[15]。

總之，甲基汞暴露導致胞外谷氨酸蓄積，使NMDA受體過度激活，細胞內Ca2+超載，誘發NO的神經毒性作用，導致神經元細胞死亡，使學習記憶功能受損。

3 NMDAR異常表達

N-甲基-d-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)是由神經遞質谷氨酸控制的陽離子通道，主要存在于CNS谷氨酸能突觸的突觸后側和突觸前側，被認為是學習和記憶的基礎，目前已經確定的NMDAR 亞基共有7 個：1 個NR1、4個NR2(A、B、C和D)和2個NR3(A、B)亞基[16]。

當CaM增加時，細胞會反饋性調節鈣蛋白酶活力增加，暴露于甲基汞后，鈣蛋白酶活力明顯升高，NMDA 受體的mRNA和蛋白質表達水平均出現不同程度的降低，可能是由于細胞內鈣超載反饋性調節鈣蛋白酶活力升高，鈣蛋白酶水解CaM的同時降解NMDAR，導致NMDAR 表達下降[17]。王欣梅等[18]證實了大鼠在出生后第1、2周暴露于甲基汞會導致學習記憶能力明顯下降，且NMDAR2 的mRNA 表達異常，推測當甲基汞誘發NMDAR 表達異常特別是NMDAR2 的表達異常時會引起學習記憶能力的下降。

4 鐵死亡

2012 年Dixon 等[19]首次發現了一種新型的細胞死亡方式——鐵死亡(ferroptosis)，它是一種鐵依賴性的、以細胞內脂質活性氧(lipid reactive oxygen species，L-ROS)蓄積為特征的細胞死亡，在細胞形態、生化和基因水平方面與細胞凋亡、壞死和自噬有明顯的差異。谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)是一種含有硒基的降脂酶，可以降低脂膜中的過氧化物，抑制其活性是誘導細胞發生鐵死亡的重要因素之一[20]。研究表明[21]，甲基汞暴露可使GPX4的活性和表達均降低。GSH對于GPX4發揮功能至關重要，其合成直接影響GPX4活性發揮，而甲基汞可使細胞內GSH的合成減少。氧化應激產生的ROS可與脂質膜上的多不飽和脂肪酸相互作用形成可致細胞死亡的L-ROS，而GPX4 則可抑制L-ROS 的積累，當GPX4活性下降則會導致L-ROS的積累從而誘導細胞發生鐵死亡[22]。

抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉運體(cystine/glutamate antiporter system，System Xc-)是誘導細胞發生鐵死亡的重要機制[23]。System Xc-是細胞內重要的抗氧化體系，可介導谷氨酸的胞外轉運和胱氨酸(cystine，CySS)的胞內轉運并參與細胞內GSH 的生物合成。甲基汞暴露引起細胞外谷氨酸含量過高時，System Xc-則會抑制細胞對CySS 的攝取，而CySS 是GSH 生物合成的重要物質，抑制System Xc-而導致細胞內CySS 和GSH 含量減少，進而導致神經元上自由基的積累，最終導致細胞鐵死亡的發生[13]。

鐵死亡的概念自從被提出后便逐漸成為科學研究的熱點，但是目前關于甲基汞誘發細胞鐵死亡機制的研究還不夠成熟，因此關于甲基汞誘發細胞發生鐵死亡對大腦學習記憶的影響機制還需要進一步的探討和闡明。

5 自 噬

自噬，又稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，是一種高度保守的細胞代謝的過程，由溶酶體介導對細胞內組分和細胞器的降解，在維持細胞的物質能量平衡方面發揮著重要作用，被認為有利于細胞的存活。既往研究認為，在進化上高度保守的細胞自噬是一種非選擇性的維持細胞穩態的過程，可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬，目前研究最廣泛的是巨自噬[24]。哺乳動物雷帕霉素靶標(mammalian target of rapamycin，mTOR)，是一種由人類mTOR 基因編碼產生的蛋白激酶，激活mTOR 抑制自噬，抑制mTOR 激活自噬，激活mTOR 會下調空泡型ATP酶的表達，破壞溶酶體和自噬酸化，引起自噬功能障礙[25]。研究發現，人神經干細胞暴露于甲基汞(0.01～1 μmol/L)后，mTOR 水平呈劑量依賴性下降，表明甲基汞過度激活自噬，導致自噬系統失調[26]。不過，目前關于甲基汞抑制mTOR 表達的機制有待探究。

自噬發生后，自噬微管相關蛋白輕鏈3(light chain 3，LC3)首先被自噬相關蛋白4(autophagy related protein 4，Atg 4)分解成LC3-Ⅰ(胞質形式)，然后Atg4/Atg5/Atg16L 復合物介導LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結合生成LC3-Ⅱ(脂化形式)[27]。甲基汞暴露后細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，則說明自噬活性增強[28]。Fang等[29]研究了自噬在甲基汞誘導的星形膠質細胞神經毒性中的作用，發現甲基汞誘發了細胞自噬并以濃度和時間依賴的方式降低星形膠質細胞的活力，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化增加。Lin等[30]研究發現甲基汞通過增強神經細胞的自噬促進了自噬小體的積累，下調JNK/Vps34復合自噬誘導通路可減少自噬小體積累，減少甲基汞誘導的神經元細胞死亡，證實了甲基汞暴露導致溶酶體降解功能受損，通過JNK/Vps34復合通路誘導自噬小體的積累和神經元細胞死亡。

在正常的生理條件下，Kelch 樣ECH 相關蛋白1(Kelchlike ECH-associated protein 1，Keap1)和核因子E2 相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)在細胞質中結合形成Keap1-Nrf2復合物，其在保護細胞免受氧化應激損害的方面發揮著重要作用。當Keap1中的巰基被親電性的甲基汞修飾后，Nrf2 被激活，從而導致Nrf2 和Keap1 解離，并從細胞質轉移到細胞核[31]。當Nrf2 和Keap1 之間的相互作用被破壞時，抑制Nrf2蛋白酶體的降解，促使Nrf2在細胞內重新生成，導致Nrf2向細胞核的轉位增加，而核內增加的Nrf2可誘導激活抗氧化應答元件(antioxidant responsive element，ARE)，進一步保護細胞免受損害。Yang等[32]實驗表明，Nrf2/ARE通路的激活可保護星型膠質細胞免受甲基汞的毒性損害。泛素結合蛋白(ubiquitin binding protein，P62)是一種自噬銜接蛋白，可將自噬和Keap1-Nrf2 通路連接起來[33]。暴露于甲基汞后P62 的表達增加[34]。增加的P62可與Nrf2競爭性地結合Keap1，導致Keap1通過自噬而降解，而P62 可再次誘導Nrf2 激活，在P62 和Nrf2之間形成正反饋環路，對細胞具有保護作用[33]。P62-Keap1-Nrf2通路可保護細胞免受氧化應激的損傷，其與細胞自噬之間有一定的聯系，但具體機制有待研究。

目前，國外關于該方面的研究甚少，國內亦尚未見系統的報道，因此關于甲基汞誘發細胞自噬的機制有待深入探究。

6 表觀遺傳修飾

近年來，表觀遺傳修飾已逐漸成為神經發育研究的熱點，其調控機制主要包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和微小RNA(microRNA，miRNA)調控。研究表明，在大腦結構如海馬和前額葉皮層中，與突觸可塑性和突觸結構相關的一些基因會由于表觀遺傳修飾的改變而發生變化[35-36]。

miRNA是一類長約20～24個核苷酸的非編碼RNA，其可參與調控多種基因的表達。近年來發現的非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)在控制基因表達方面發揮著關鍵作用，部分ncRNA通過靶向相關鐵蛋白來調節鐵死亡[37]。MiR-30b-5p是一種來自人胎盤的ncRNA。Zhang 等[38]在子癇前期模型中研究發現抑制miRNA-30a-5p的表達可上調膜鐵轉運蛋白和胱氨酸谷氨酸轉運蛋白的表達，從而減輕細胞發生鐵死亡。關于甲基汞致鐵死亡的機制尚未見詳細報道，而對于ncRNA在鐵死亡中作用的研究更是少之又少，因此未來還需繼續開展相關的研究。

DNA 甲基化是指在DNA 甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，相關DNMT催化甲基通過一定的方式轉移到胞嘧啶的第5位碳原子上形成5-甲基胞嘧啶。研究發現[39]，抑制NMDA 受體的激活可以阻斷記憶相關的腦源性神經營養因子DNA的去甲基化，說明了通過NMDA受體傳遞信號對于DNA 去甲基化至關重要，暗示DNA 甲基化是NMDA 受體的一個靶點目標，但這其中更多的機制還需繼續深入探究。

神經元分化階段被認為易受化學物質誘導的表觀遺傳變化的影響，Go等[40]將組蛋白修飾作為表觀遺傳變化的代表，研究了在體外神經元分化模型中，甲基汞導致酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)基因的表觀遺傳抑制。該研究發現，細胞經甲基汞染毒后，與轉錄抑制相關的組蛋白H3K27me3在多巴胺合成的限速酶TH基因啟動子區的表達顯著增加，通過增加與TH啟動子區轉錄抑制相關的組蛋白修飾，導致TH表達顯著降低。

表觀遺傳修飾在學習記憶中的調控機制已成為神經發育研究的熱點，關于甲基汞暴露致表觀遺傳修飾改變對大腦學習記憶的影響，尚需進一步的研究。

7 展 望

甲基汞的神經毒性效應及其機制一直以來都是科研工作者研究的熱點。鐵死亡和自噬在學習記憶中的作用機制也日益受到關注，然而目前國內外關于甲基汞誘導細胞發生鐵死亡和自噬的研究相對較少，尚有諸多問題需進一步探討，今后有望成為研究的重要方向。因此，深入研究上述的幾種機制可為今后甲基汞暴露致學習記憶功能障礙的研究提供更多科學依據，對今后甲基汞誘發子代神經系統損傷的防治具有重要意義。