黑果腺肋花楸提取物的急性毒性和致突變性研究

黃超培，覃輝艷，張陸娟，王彥武，何 勵，傅偉忠

(廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530028)

黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa) 是一種薔薇科灌木，因具有較高的經(jīng)濟和生態(tài)價值，二十多年前從國外陸續(xù)引進我國種植，其果實含有豐富的營養(yǎng)和生物活性成分，具有較強的抗氧化、消炎、抗菌等功效[1-2]，已被用于食品、保健品、化妝品等產(chǎn)品[3-4]，具有很好的應(yīng)用前景。近年來，對黑果腺肋花楸果提取物的成分及活性物的功效作用研究比較多，而對它的毒性方面則少見報道，本文依據(jù)食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法對其進行急性毒性及致突變性研究，為對黑果腺肋花楸提取物的安全性進行評價及后期的相關(guān)產(chǎn)品研究開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

黑果腺肋花楸果提取物溶液，其主要功效成分為原花青素(含量為2.79%)，擬用于功能性保健食品，由山西某科技公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

SPF 級健康成年昆明種小鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心繁殖，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(桂)2014-0002，質(zhì)量合格證號45000300000854、4500030 0000864。動物飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0002，質(zhì)量合格證編號44200300016584。動物房為屏障系統(tǒng)，使用許可證號SYXK(桂)2016-0002。動物實驗室溫度為22～25 ℃，相對濕度為55%～70%。

1.3 試驗菌株

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102四種菌株，購于美國MOLTOX公司。

1.4 實驗方法[5]

1.4.1 急性經(jīng)口毒性試驗采用最大耐受量試驗法，選取體質(zhì)量為18～22 g 的昆明種成年小鼠20 只，雌、雄性各10只，試驗前禁食16 h，不限飲水。采用最大給藥量法，按0.02 mL/g 給小鼠灌胃黑果腺肋花楸果提取物溶液1次，濃度為20 mg/kg(原花青素的濃度為558 mg/kg)，灌胃后觀察、記錄小鼠的中毒表現(xiàn)，觀察14 d，以半數(shù)致死劑量(median lethal dose，LD50)評價受試物的急性毒性強弱。

1.4.2 細菌回復(fù)突變試驗采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102 四種試驗菌株，設(shè)8、40、200、1 000、5 000 μg/皿5個濃度組，同時設(shè)自發(fā)回變對照、溶劑對照和陽性誘變劑對照。自發(fā)回變對照不加受試物，其余條件相同。采用平板摻入法，將試驗菌株增菌液0.1 mL、受試溶液0.1 mL，代謝活化組再加入10% S9混合液0.5 mL，依次加入保溫的頂層培養(yǎng)基試管內(nèi)，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，迅速均勻鋪開。每個濃度組的每種菌株做3 個平行皿，在37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，計數(shù)每皿的回變菌落數(shù)，計算各濃度組平均回變菌落數(shù)與自發(fā)回變菌落數(shù)的比值(mutaion ratio，MR)，以MR＞2 且存在濃度-反應(yīng)關(guān)系者為陽性結(jié)果。重復(fù)試驗1次。

1.4.3 骨髓細胞微核試驗設(shè)2.5、5、10 g/kg 3 個濃度組， 同時設(shè)陰性( 溶劑) 對照和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)陽性對照，每組10 只25～30 g 的昆明種成年小鼠，雌、雄性各5 只。按0.02 mL/g給小鼠灌胃受試物2 次(間隔24 h)，于末次給受試物后6 h 處死小鼠，取胸骨骨髓制片，甲醇固定，Giemsa 染色，在油鏡下觀察每只小鼠的1 000 個嗜多染紅細胞(PCE)，計數(shù)含微核的細胞數(shù)，計算微核細胞率。同時計數(shù)200 個嗜多染紅細胞，計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比值(PCE/NCE)。

1.4.4 精子畸形試驗劑量及對照組設(shè)計同1.4.3項，每組10只25～35 g的昆明種成年雄性小鼠，每天灌胃給受試物1 次，連續(xù)5 d，于末次給受試物后第30天處死動物，解剖取出兩側(cè)附睪，置生理鹽水中輕輕將其撕裂、搖晃，過濾取精子制片，伊紅染色，在高倍鏡下觀察每只小鼠的1 000 個完整精子，計算精子畸形率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗動物的體質(zhì)量、菌落數(shù)、微核細胞率、PCE/NCE及精子畸形率等指標(biāo)的統(tǒng)計結(jié)果以xˉ±s表示。骨髓細胞微核試驗各組間的微核細胞率的均數(shù)比較采用Poisson分布的近似正態(tài)法進行統(tǒng)計分析，精子畸形試驗各組間的精子畸形率的均數(shù)比較采用χ2檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗

給予黑果腺肋花楸提取物溶液14 d內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)小鼠有中毒體征和死亡，小鼠的進食和飲水未見異常，小鼠的體質(zhì)量增長未受到明顯影響，見表1。觀察期結(jié)束解剖小鼠，肉眼觀察心臟、肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、胰腺、睪丸、卵巢及胃腸等主要器官組織未見異常。由此可見，該受試物對小鼠的急性經(jīng)口毒性LD50大于20 g/kg。

表1 黑果腺肋花楸提取物對小鼠的急性毒性試驗結(jié)果(n=10)

表2 黑果腺肋花楸提取物細菌回復(fù)突變試驗結(jié)果

2.2 細菌回復(fù)突變試驗

細菌回復(fù)突變試驗的結(jié)果見表2，在加入或不加入S9代謝活化系統(tǒng)，黑果腺肋花楸提取物各濃度組和陰性對照的4 種試驗菌株的回變菌落數(shù)與自發(fā)回變菌落數(shù)相接近，MR 值均小于2，且不存在濃度-反應(yīng)關(guān)系，而各陽性對照物均可誘發(fā)測試菌株的回復(fù)突變菌數(shù)明顯增高，MR 值2.99～133.64，表明該受試物未呈現(xiàn)誘發(fā)測試菌株的回復(fù)突變效應(yīng)。重復(fù)試驗的結(jié)果一致。

2.3 骨髓細胞微核試驗

骨髓細胞微核試驗的結(jié)果見表3，黑果腺肋花楸提取物各劑量組的微核率及PCE/NCE值與陰性對照組接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，各劑量組的PCE/NCE值均不少于陰性對照組的20%，而CTX陽性對照組的微核率則顯著高于陰性對照組(P＜0.01)，提示未見該受試物對小鼠的骨髓細胞有損傷和抑制作用。

表3 黑果腺肋花楸提取物對小鼠骨髓微核發(fā)生率的影響(n=10#)

2.4 精子畸形試驗

精子畸形試驗的結(jié)果見表4，黑果腺肋花楸提取物各劑量組的精子畸形率與陰性對照組接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而CTX 陽性對照組的精子畸形率則顯著高于陰性對照組(P＜0.01)，提示未見該受試物對雄性小鼠的精子產(chǎn)生畸變作用。

表4 黑果腺肋花楸提取物對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響(n=10)

3 討 論

黑果腺肋花楸被引進我國種植的時間不長，迄今未見有中毒報道，現(xiàn)有文獻尚無黑果腺肋花楸果實、果汁和提取物的任何有害和毒性作用的數(shù)據(jù)[6]。但是黑果腺肋花楸提取物是用化學(xué)溶劑乙醇(70%濃度)進行提取，再經(jīng)過濾、濃縮和干燥獲得的，除了含原花青素外，還含有多酚、黃酮等多種成分，在進行生產(chǎn)和推向市場之前，為了安全起見，對其進行毒理學(xué)安全性評價是必要的。

本研究檢測黑果腺肋花楸提取物的急性毒性，并聯(lián)合體外細菌回復(fù)突變試驗與哺乳動物體內(nèi)骨髓細胞微核試驗和精子畸形試驗，分別檢測基因水平、體細胞染色體及生殖細胞基因的損傷作用，對其潛在的致突變性進行檢測。試驗結(jié)果，在給予黑果腺肋花楸提取物后，小鼠未出現(xiàn)中毒體征和死亡，急性經(jīng)口毒性LD50大于20 g/kg(原花青素的濃度為558 mg/kg)，按照我國的食品急性毒性(LD50)分級標(biāo)準(zhǔn)評價，該提取物的急性經(jīng)口毒性屬于無毒級；在體外細菌回復(fù)突變試驗，加入和不加入S9代謝活化系統(tǒng)兩種條件下，黑果腺肋花楸提取物8、40、200、1 000、5 000 μg/皿5個濃度組的4 種試驗菌株的回變菌落數(shù)與自發(fā)回變的菌落數(shù)相接近，MR值均小于2，實驗結(jié)果為陰性；在哺乳動物體內(nèi)，黑果腺肋花楸提取物2.5、5、10 g/kg 3 個濃度組的微核率、PCE/NCE 值和精子畸形率，與陰性對照組比較均無顯著性差異，表明未對小鼠的骨髓細胞有損傷和抑制作用，也未對雄性小鼠的精子產(chǎn)生畸變作用。從以上結(jié)果來看，未發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸提取物有急性毒性和致突變性作用，初步認為黑果腺肋花楸提取物具有一定的安全性，可以開展后續(xù)的毒理學(xué)試驗以便對其進行更全面的安全性評價。但是，本研究只進行了體外細菌回復(fù)突變試驗和選用了一種嚙齒類動物進行體內(nèi)試驗，未選用非嚙齒類動物進行試驗，同時僅用成年動物進行試驗，未能反映年幼和老年動物的體內(nèi)反應(yīng)，這樣得到的研究結(jié)果有一定的局限性，有待進一步深入研究。