mTOR抑制劑AZD2014對肝癌細胞的增殖抑制作用及其機制研究

林凱煌，蔡高陽，劉新城

(1．汕頭大學醫學院第二附屬醫院胃腸外科，廣東 汕頭 515065；2．汕頭大學醫學院第二附屬醫院泌尿外科，廣東 汕頭 515065)

肝細胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來，其發病率和病死率均有升高的趨勢[1]。對于早期肝癌患者來說，最有效的治療方式包括腫瘤局部消融、手術切除和肝臟移植治療；但對于中晚期肝癌患者，研究者們卻尚未找到合適的治療方法[2-4]。近年來，分子靶向藥物治療的出現給中晚期肝癌患者帶來了新希望[5]，科學家們把可以同時阻斷mTORC1 和mTORC2信號的哺乳動物雷帕鳴靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制劑稱為雙mTOR 抑制劑，目前比較常見的雙mTOR 抑制劑有PP244、AZD8055 及AZD2014 等，有研究表明，雙mTOR 抑制劑AZD2014有較強的抗腫瘤作用，它可以誘導腫瘤細胞出現凋亡、細胞周期阻滯和自噬，且可抑制腫瘤細胞的上皮-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)進程[6-7]。然而截至目前，AZD2014的作用靶點尚不清楚。有研究表明，腫瘤細胞中含植物同源結構和環指域泛素樣蛋白1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1)的表達可被mTOR 抑制劑Torin-2顯著抑制[8]，這表明UHRF1可能是mTOR 抑制劑Torin-2發揮抗腫瘤作用的藥物靶點。我們的前期研究表明，mTOR 抑制劑AZD2014 具有明顯的抗腫瘤作用[6]。為進一步確定UHRF1 是否為mTOR 通路抑制劑發揮抗腫瘤作用的藥物靶點。我們用不同濃度的AZD2014 來處理人肝癌細胞HCCLM3，并檢測AZD2014對肝癌細胞增殖及細胞中UHRF1表達水平的影響，進而探討AZD2014在肝細胞癌中發揮抗腫瘤作用的機制。

1 材料與方法

1.1 受試物

HCCLM3 細胞購于復旦大學肝癌研究所；AZD2014 購于美國Selleckchem 公司；Trizol、逆 轉 錄試劑盒及熒光定量PCR 試劑盒均購于日本TaKaRa 公司；CCK-8試劑盒購于日本同仁公司；UHRF1抗體購于美國Abcam公司。

1.2 CCK-8法檢測細胞增殖情況

將適量狀態良好的HCCLM3 細胞接種于96 孔板中，置于37 ℃、CO2體積分數為5%、飽和濕度的細胞培養箱中培養，待細胞生長至底面覆蓋率為30%～40%時分別加入完全培養基和不同濃度的受試物，實驗分為空白對照組，陰性對照組，AZD2014 10、100、500、1 000 nmol/L 組。繼續培養細胞，分別于加入受試物后0、24、48、72及96 h按操作說明向各細胞培養孔中加入適量CCK-8 溶液，37 ℃條件下孵育1 h，然后用酶標儀測定不同時間點各細胞培養孔在450 nm處的吸光度D(450)，并以此繪制各組細胞的增殖曲線。

1.3 熒光定量PCR 檢測肝癌細胞內UHRF1 mRNA的表達

HCCLM3細胞經不同濃度AZD2014處理96 h后棄去舊培養基，冷PBS 洗滌細胞2 次，再向各培養孔中加入適量Trizol，輕輕搖動培養板，使細胞裂解液流遍所有細胞表面，反復吹打使其充分裂解成勻漿，加入氯仿，離心后取上清，再加入異丙醇，離心后用75%乙醇洗脫，風干后用滅菌用水溶解，測定RNA濃度后取適量RNA按說明配制反應體系進行逆轉錄反應，再取適量反應產物按熒光定量PCR試劑盒說明配制反應體系并進行反應(引物序列見表1)，根據每個樣品不同復孔的CT值計算各組平均CT值及△CT值(△CT=CT，UHRF1-CT，GAPDH)，并由此計算出2-ΔΔCT值。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.4 Western blot檢測肝癌細胞內UHRF1蛋白的表達

HCCLM3細胞經不同濃度AZD2014處理96 h后用RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑PMSF 提取細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，裂解并煮沸變性后，取適量蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后封閉非特異性抗體，再加上合適濃度的UHRF1 抗體，4 ℃孵育過夜；次日洗凈UHRF1 抗體后加上HRP 耦聯的二抗，搖床上室溫孵育1 h，洗凈后進行化學發光檢測、圖像采集，之后再根據ImageJ軟件計算出的各蛋白條帶的相對灰度值來計算蛋白的相對表達水平。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析。計量資料用±s表示，實時熒光定量PCR數據分析采用單因素方差分析，增殖實驗數據分析采用單因素方差分析。檢驗水準為α=0.05，采用雙側性檢驗。

2 結 果

2.1 不同濃度AZD2014對肝癌細胞增殖能力的影響

細胞增殖實驗結果顯示，10、100、500、1 000 nmol/L 的AZD2014 均可顯著抑制肝癌細胞的增殖能力，抑制作用程度與其濃度呈正相關(P＜0.05)，且AZD2014 在濃度為500 和1 000 nmol/L 時對肝癌細胞的增殖抑制作用最強(P＜0.05，圖1)。

圖1 不同濃度AZD2014對肝癌HCCLM3細胞增殖的影響

2.2 AZD2014 對肝癌細胞中UHRF1 mRNA 表達的影響

實時熒光定量PCR 檢測結果見圖2，與空白對照或陰性對照組相比，可見HCCLM3 細胞中UHRF1 mRNA 的表達水平在經500 和1 000 nmol/L AZD2014處理后顯著下降(P＜0.05)，且濃度為1 000 nmol/L 時最明顯，但10 和100 mmol/L 濃度的AZD2014 對HCCLM3 細胞中UHRF1 mRNA 的表達水平無明顯影響。據此我們初步認為，UHRF1可能是mTOR抑制劑AZD2014發揮抗腫瘤作用的藥物靶點。

圖2 不同濃度AZD2014對肝癌細胞內UHRF1 mRNA表達的影響

2.3 AZD2014對肝癌細胞中UHRF1蛋白表達的影響

Western blot 檢測結果見圖3，與空白對照或陰性對照組相比，可見HCCLM3細胞中UHRF1蛋白的表達水平在經500和1 000 mmol/L AZD2014處理后顯著下降，且濃度為1 000 mmol/L 時最明顯，但10 和100 mmol/L 濃 度的AZD2014 對HCCLM3 細胞中UHRF1 蛋白的表達水平無明顯影響，這和上述mRNA 表達實驗結果是一致的。這更加進一步證明，mTOR 抑制劑AZD2014可能是通過降低肝癌細胞中UHRF1的表達來發揮抗腫瘤作用的。

圖3 不同濃度AZD2014對肝癌細胞內UHRF1蛋白表達的影響

3 討 論

mTOR 在體內主要以mTORC1 和mTORC2 兩種形式存在，與腫瘤細胞的增殖能力密切相關，參與腫瘤的發生發展[9-10]。活化的mTORC1使4EBP1和S6K發生磷酸化，促進細胞內蛋白質的合成，進而提高細胞的增殖能力[11]；mTORC2 則可活化AKT 信號通路，參與細胞內多種生理過程[12]。然而，mTOR 信號通路異常激活阻礙細胞的分化，激發腫瘤的生成，加重腫瘤的惡化程度[13]。有研究表明，約一半的肝細胞癌患者存在mTOR 信號通路異常激活[14]。因此，針對mTOR 相關信號通路的藥物研究對肝細胞癌的治療具有重要意義。既往研究表明，mTOR 抑制劑除了本身具有抗腫瘤作用，還能使得腫瘤細胞對化療藥物更敏感[15-16]。近年來，研究者發現AZD2014是一種較好的mTOR 抑制劑，它不僅能較完全地阻斷mTORC1信號，還能阻斷mTORC2 信號，具有理想的抗腫瘤作用[6]。在本研究中我們發現，UHRF1可顯著抑制肝癌細胞的增殖能力，但其具體作用機制尚不明確。

UHRF1是近年來發現的一個與腫瘤進展相關的核蛋白基因[17]，它通過與體內DNA甲基轉移酶以及組蛋白去乙酰化酶等相互作用，參與調節DNA甲基化及染色質修飾等基因表達調控[18]，并調控體內抑癌基因的表達，從而影響腫瘤的進展[19]。我們既往的研究表明，UHRF1在肝細胞癌組織中的表達水平與肝癌患者的預后呈負相關，此外，敲低細胞中UHRF1的表達不僅可以顯著抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲以及EMT 進程，還可以誘導腫瘤細胞出現細胞周期阻滯[20]。在本實驗中我們發現，與對照組相比，經AZD2014處理后，肝癌HCCLM3細胞的增殖能力受到明顯抑制，且AZD2014濃度越高，肝癌細胞增殖能力被抑制得更明顯；同時我們還發現，經AZD2014處理后肝癌細胞內UHRF1的表達水平顯著下降，因此，我們認為，mTOR 抑制劑AZD2014 可能是通過降低肝癌細胞中UHRF1的表達來發揮抗腫瘤作用的。當然，本研究仍存在一些不足，如未通過進一步實驗來驗證AZD2014是通過何種途徑來影響UHRF1的表達等，仍需繼續深入研究。

通過本研究我們發現，AZD2014可顯著抑制肝癌細胞的增殖能力，且可顯著降低肝癌細胞內UHRF1的表達水平，因此我們認為，AZD2014可能是通過抑制肝癌細胞內UHRF1的表達來發揮抗腫瘤作用的。