橙皮苷對口腔鱗狀細胞癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其與紫杉醇聯合應用的作用

陳德榮 張曉云 王秀珍 任婷遠 王榮德

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)常發生于口腔黏膜，是惡性程度較高且容易轉移的鱗狀細胞癌[1]。由于其發展迅猛且對于常規療法不敏感，導致患者的生存率較低，嚴重威脅著人們的生命和健康[2]。紫杉醇(PTX)是作用于細胞微管的抗腫瘤藥物，對OSCC有明顯療效，但PTX存在毒副作用較強且容易產生耐藥性的問題[3-4]。研究表明，使用PTX單藥治療不如聯合用藥的療效顯著。目前聯合用藥方案已經廣泛運用于多種惡性腫瘤治療，中藥作為新型化療佐劑，在提高腫瘤化療水平和減輕化療副作用方面受到關注[5-6]。橙皮苷(hesperidin，HES)是天然的黃酮類化合物，具有抗老化、抗炎、提高免疫力及神經保護的作用，能夠誘導肝癌，乳腺癌，肺癌及胃癌細胞發生凋亡[7-9]，具有良好的抗癌活性，其對口腔鱗狀細胞的作用尚不明確，本文從體內外實驗檢測其對OSCC的作用及其和PTX聯合使用后的效果。

1 材料與方法

1.1 細胞株和動物分組

人口腔鱗狀細胞癌Tca8113細胞(南方醫科大學細胞生物學實驗室)；SPF級BALB/c雌性裸鼠(18～20 g，5～6 周齡)(許可證號: SCXK 2017-0022，上海斯萊克實驗動物有限公司)。裸鼠飼養在SPF級實驗動物中心，飼養溫度為23～26 ℃，濕度為35%。分為空白組，HES組,PTX組，二倍紫杉醇(2×PTX組)和HES+PTX組，每組5 只。分別用生理鹽水，10 mg/kg HES，10 mg/kg PTX，20 mg/kg PTX和10 mg/kg HES+10 mg/kg PTX處理，經實驗動物倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器

橙皮苷(CAS: 520-26-3，純度≥98%)(成都瑞芬思生物科技有限公司)；DMEM培養基(Gibco公司,美國)；胰蛋白酶-EDTA細胞消化液(TE)、FBS 胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)；一抗和二抗均(Santa公司,美國)；原位末端標記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司)；CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒及ECL發光試劑盒(北京碧云天生物科技有限公司)。

ML-dr3518酶標分析儀(上海酶聯生物科技有限公司)；CytoFLEX流式細胞儀(貝克曼庫爾特有限公司,美國)；Western blot電泳儀及轉膜儀(Bio-Rad公司,美國)；裸鼠飼養籠設備(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 CCK-8檢測增殖抑制情況 將Tca8113細胞以1×104/孔接種至96 孔板中并放入培養箱中靜置培養，當細胞滿度約為70%后換液處理，用1% FBS的DMEM孵育2 h，隨后分成8 個濃度組：空白組，(5、10、15、20 μmol/L)HES，10 μmol/L PTX，20 μmol/L PTX及10 μmol/L HES+20 μmol/L PTX。處理24 h后，加入15 μl CCK-8溶液，利用酶標儀在490 nm波長下測量吸光度值，實驗重復3 次并計算細胞存活率。

1.3.2 流式細胞術法檢測細胞凋亡情況 將Tca8113細胞接種至6 孔板，過夜培養。按空白組，10 μmol/L HES，20 μmol/L HES，10 μmol/L PTX，20 μmol/L PTX及10 μmol/L HES+10 μmol/L PTX處理。隨后收集細胞于Tube管中，5 000 r/min離心4～5 min，舍去上層清液，每管中加入95 μl 1×結合緩沖液重懸細胞，再加入3 μl Annexin V-FITC和2 μl PI染料，并設置單色對照組空白對照組，利用流式細胞儀對凋亡的細胞數量進行統計分析。

1.3.3 Transwell法檢測細胞遷移情況 將Tca8113細胞消化離心重懸，調整濃度為5×106個/ml，取200 μl加到小室的上層。下層加入500 μl含有10%FBS的DMEM培養基，培養24 h后吸棄培養液，擦去小室上層沒有侵襲或遷移的細胞。PBS沖洗2 次，4%多聚甲醛固定15 min。然后用0.1%結晶紫進行染色0.5 h。放大400 倍隨機觀察5 個視野，計數遷移至小室微孔膜下層的細胞數，并定量分析。

1.3.4 構建裸鼠移植瘤模型及分組藥物處理 將Tca8113細胞密度調整至2×107/ml，以每只裸鼠5×106個細胞皮下接種，注射器針管要插在裸鼠背部右側靠近腋窩處，注入細胞后用指肚輕輕按壓注射的位置，每天觀察裸鼠及腫瘤狀況。當接種裸鼠均出現直徑大5 mm3的皮下質硬結節時，根據分組的實驗方案，隔天灌胃給藥1 次，持續4 周，實驗中各組裸鼠未出現死亡情況。停藥后，犧牲裸鼠，剝離腫瘤。

1.3.5 對裸鼠瘤小鼠腫瘤體積及重量的測定 每3 天用游標卡尺對瘤體的體積進行測量，計算公式為V=1/2×長徑×短徑2；待實驗結束犧牲小鼠后，完整剝離腫瘤，記錄瘤體最終的質量；計算腫瘤抑制率=(空白對照組瘤重均值-實驗組瘤重均值)/空白組對照瘤重均值×100%。

1.3.6 TUNEL法檢測各組腫瘤組織中的細胞凋亡情況 將裸鼠的腫瘤組織固定、石蠟包埋，以4 μm為厚度進行連續切片，隨后根據TUNEL檢測試劑盒說明書操作，對腫瘤組織中的細胞凋亡情況進行檢測。在400倍的光學顯微鏡下觀察計數，計算細胞凋亡率=凋亡細胞數/腫瘤細胞總數。

1.3.7 Western blotting檢測腫瘤組織細胞中凋亡相關蛋白變化 取移植瘤組織，用超聲波破碎儀破碎，在4 ℃離心機中以14 000×g離心30 min，取上清蛋白，BCA法測蛋白含量，配置10%～15%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，隨后轉移至NC膜上，脫脂乳封閉2 h，一抗4 ℃水平搖床孵育過夜，TBST洗膜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，ECL發光試劑進行顯色，再通過化學發光成像系統進行拍照。內參選擇GAPDH，并利用Image J軟件對所出條帶進行灰度分析。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 CCK-8實驗檢測Tca8113細胞的增殖情況

HES以濃度依賴性方式抑制Tca8113細胞的增殖，IC50為10.68 μmol/L；在10 μmol/L濃度下，HES的增殖抑制作用等同PTX；在聯合處理組中，Tca8113細胞的存活率進一步降低為16.38%±1.24%，在20 μmol/L PTX和20 μmol/L HES處理組中，Tca8113細胞的存活率分別為28.73%±3.64%和30.28%±1.52%，與10 μmol/L HES+10 μmol/L PTX相比具有顯著性差異(表 1)。

2.2 HES聯合PTX對OSCC的誘導凋亡作用

HES和PTX均具有較好的誘導凋亡能力且PTX略優于HES；10 μmol/L HES+10 μmol/L PTX聯合處理時，凋亡細胞比例達到83.68%，高于2 種藥物分別以20 μmol/L處理時對細胞產生的誘導凋亡效果，具有顯著性差異(表 1)。

2.3 HES聯合PTX抑制OSCC的遷移及侵襲

10 μmol/L HES和PTX對Tca8113細胞沒有明顯的遷移抑制能力，但是20 μmol/L HES和PTX能夠在一定程度上抑制細胞遷移及侵襲，但當以10 μmol/L HES+10 μmol/L PTX聯合處理時，遷移及侵襲的細胞數目顯著降低，效果優于20 μmol/L PTX，差異具有顯著性(P<0.05)(圖 1)。

表 1 HES聯合PTX對Tca8113細胞的增殖抑制作用和誘導凋亡作用

圖 1 HES聯合PTX對Tca8113細胞遷移的影響

2.4 HES聯合PTX對OSCC裸鼠移植瘤的抑制作用

HES+PTX組的瘤體體積始終低于2×PTX組，處在各組最低(圖 2)；HES組、PTX組、2×PTX組和HES+PTX組的瘤體質量和腫瘤抑制率均低于對照組，且HES+PTX組腫瘤抑制率高于HES組、PTX組、2×PTX組，差異有統計學意義(P<0.05)(表 2)。

圖 2 橙皮苷聯合紫杉醇對裸鼠移植瘤體積的影響

2.5 HES聯合PTX對裸鼠移植瘤組織的病理形態特征的影響

HE染色結果可以看出對照組腫瘤細胞豐富，排列密集，細胞核和細胞質的比例較大；HES組、PTX組、2×PTX組和HES+PTX組的腫瘤細胞數目減少，排列稀疏，大部分細胞胞漿透明成空泡狀，可見凋亡小體及大范圍壞死區(圖 3)。

表 2 HES聯合PTX對裸鼠移植瘤重量的影響及腫瘤抑制率

圖 3 HES聯合PTX對裸鼠移植瘤瘤體組織病理形態影響

2.6 HES聯合PTX對OSCC裸鼠移植瘤細胞凋亡的影響

空白對照組腫瘤組織凋亡細胞很少，而在實驗組中，HES組、PTX組、2×PTX組和HES+PTX組的黃棕色細胞數量較對照組增加，且HES+PTX組凋亡數量最多，較HES組、PTX組、2×PTX組的凋亡細胞數差異有統計學意義(P<0.05)(圖 4)。

2.7 HES聯合PTX對OSCC裸鼠移植瘤凋亡及遷移蛋白表達的影響

Western blotting結果如圖 5，凋亡蛋白中，HES組、2×PTX組和HES+PTX組的裸鼠移植瘤組織中Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2的蛋白表達明顯降低，與空白組比較，差異有顯著性(P<0.05)，同時這幾種蛋白在HES+PTX組較HES組和2×PTX的表達差異有統計學意義(P<0.05)。在細胞遷移蛋白中，HES+PTX組的裸鼠移植瘤組織中MMP-9，N-cadherin及snail蛋白表達明顯下調，E-cadherin蛋白表達升高，與空白對照，HES組及2×PTX組相比具有顯著性差異。

3 討 論

化學治療的不斷深入及多種化療藥物的開發及應用，使其在OSCC發揮著越來越重要的作用[10-11]。不同的藥物聯合使用，不僅可以減少部分不良反應較大藥物的用量，同時也可以達到更好的效果[12]。中藥提取物近年來在多種疾病上的應用和取得的療效已經得到廣泛認可[13]。HES從中藥橙皮中提取出，被證實具有抗老化、抗炎、提高免疫力及神經保護的作用并能夠對幾種消化道癌癥起到抑制增殖的作用。本研究證實HES對OSCC具有增殖抑制作用，當聯合PTX后，對細胞的增殖抑制率高達16.38%±1.24%。為了驗證兩者共同使用引起的增殖抑制作用是協同作用還是疊加作用，檢測20 μmol/L PTX組細胞存活率，可看出10 μmol/L HES+10 μmol/L PTX對細胞的增殖抑制效果要強于20 μmol/L PTX，證明了HES能夠協同PTX增強對OSCC的增殖抑制作用。利用流式細胞術和Transwell實驗檢測細胞凋亡情況和遷移情況，可以看出當以10 μmol/L HES+10 μmol/L PTX聯合處理時，凋亡細胞比例達到83.68%，遷移細胞數量比例降低65%，顯著優于2 種藥物分別以20 μmol/L 處理時對細胞產生的效果，說明兩種藥物聯用具有較好的協同作用。

圖 4 HES聯合PTX對裸鼠移植瘤瘤體組織細胞凋亡的影響

圖 5 HES聯合PTX對OSCC裸鼠移植瘤細胞中凋亡及遷移相關蛋白表達的影響

體內實驗是驗證藥效的關鍵步驟，有研究表明10 mg/kg的PTX對瘤體的生長抑制率為50%左右，因此本研究同樣選取了10 mg/kg的PTX為對照濃度。此前有研究證明HES具有體內抗癌活性的同時認為HES的處理濃度在10～15 mg/kg，為研究HES及PTX聯合使用的抗癌效果，將HES的處理濃度定為10 mg/kg。結果顯示10 mg/kg HES+10 mg/kg PTX對裸鼠瘤體的體積和質量的抑制程度進一步加大，腫瘤抑制率為66.17%，顯著優于20 mg/kg PTX組。HE染色和TUNEL實驗檢測細胞凋亡率，結果顯示，HES+PTX組凋亡數量最多達到78.38%，較HES組、PTX組、2×PTX組的凋亡細胞數差異有統計學意義(P<0.05)。通過對瘤體組織蛋白表達檢測結果顯示，2×PTX組和HES+PTX組的裸鼠移植瘤組織中Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2的蛋白表達明顯降低，但是HES+PTX組的變化程度要大于2×PTX組，兩組之間的差異有顯著性(P<0.05)，說明HES聯合PTX后能夠提高對腫瘤的誘導凋亡能力。

體外實驗已從細胞層面上證明HES和PTX聯用對Tca8113細胞具有較好的抑制遷移及侵襲的作用，在分子水平上檢測遷移相關蛋白的表達中發現HES處理組和2×PTX處理組的遷移相關蛋白的表達和空白組沒有差異，但HES+PTX組能下調裸鼠移植瘤組織中MMP-9，N-cadherin及Snail蛋白表達，上調E-cadherin蛋白的表達，早有研究表示這些蛋白與調節細胞遷移相關[14-15]，表明PTX和HES聯用具有抑制細胞遷移的能力。

綜上所述，HES對和PTX聯用能夠顯著促進腫瘤細胞凋亡，抑制癌細胞發生遷移，可能發揮協同抗癌作用，其協同效應值得進一步深入研究。