多光子成像技術的生物醫學應用新進展*

李少強 耿俊嫻 李艷萍 劉雄波 彭曉 屈軍樂 劉麗煒 胡睿

(深圳大學物理與光電工程學院， 教育部/廣東省光電子器件與系統重點實驗室， 深圳 518060)

多光子成像技術由于具有低侵入性、強穿透力、高空間分辨率等優點， 自問世以來便成為生物醫學研究的有力工具， 在癌癥病理、神經疾病及腦功能成像等方面取得了一系列較好的研究成果. 目前， 應用較為廣泛的多光子成像技術是雙光子激發熒光顯微成像技術， 其在生物醫學應用中具有較大的發展潛力. 本文詳細闡述了多光子成像技術在多色成像、功能成像及成像深度等方面的生物醫學應用新進展， 包括多色雙光子激發熒光顯微成像、雙光子激發熒光壽命顯微成像、雙光子光纖內窺成像和三光子顯微成像技術， 并簡要介紹這幾種多光子成像技術的原理與特性， 最后展望其未來發展前景.

1 引 言

多光子激發是指在具有高光子密度的入射光激發下， 處于基態的分子/原子同時吸收多個光子后躍遷到激發態， 經過弛豫過程躍遷到亞激發態，最后自發輻射回到基態， 釋放出頻率略小于多倍入射光頻率的熒光光子[1]. 1990 年Denk 等[2]開發了第一臺雙光子激光掃描顯微鏡后， 多光子成像就以其低侵入性、高穿透性、高空間分辨率等優勢走進人們的視野. 目前最常見的多光子成像技術是雙光子激發熒光(two-photon excited fluorescence，2PEF)和三光子激發熒光(three-photon excited fluorescence， 3PEF)成像， 它們對應的能級圖如圖1 所示.

相較于單光子激發熒光、激光掃描共聚焦和寬場成像等技術， 多光子成像技術具有以下優點：1)多光子成像技術通常采用的激發光為波長較長的近紅外光， 相比可見光， 近紅外光在生物組織中的穿透能力更強， 能夠觀察到生物組織中更深層的信息， 侵入性較低； 2)多光子成像只有在激發光焦點附近的區域才能激發熒光， 因此多光子成像技術具有天然的光學層析能力， 能更好地對生物組織進行三維成像； 3)多光子成像在樣品的非焦點區域不產生熒光， 能自動抑制離焦信號， 因而相比寬場成像技術， 多光子成像能實現近乎衍射極限的空間分辨率， 因此能觀察到組織內更細微的結構； 4)與共聚焦成像技術相比， 多光子成像技術不需要使用針孔濾波， 熒光收集效率高.

圖1 2PEF、3PEF 過程能級圖. 2PEF 和3PEF 都是非直接激發輻射過程， 存在非輻射能量轉移. 圖中 νp 為吸收光子頻率， νf 為發射熒光頻率， ν NR 為非輻 射能量轉移.Fig. 1. Energy level diagram of 2PEF and 3PEF process.Both 2PEF and 3PEF are indirect excitation radiation processes， and there is non-radiative energy transfer. In the figure， νp is the frequency of absorbed photons， νf is the frequency of emitted fluorescence， and ν NR is the non-radiative energy transfer.

2PEF 是目前最常見的多光子成像技術， 因其具有如上優點而被廣泛應用于生物醫學領域， 其對系統要求較簡單， 許多活體內源性熒光團或光學探針都具有雙光子吸收效應， 能進行雙光子激發熒光顯微成像. 而且2PEF 容易與其他光學手段如熒光壽命顯微成像技術、光纖內窺成像技術、光片技術等結合， 實現樣品信息更多維度信息或更高的成像指標. 但其在應用時也存有缺陷， 致使其在多色成像、功能成像、成像深度等方面仍面臨著巨大挑戰.例如， 利用2PEF 研究含有多種熒光團的樣品時，難以實現多種熒光團的同時最優激發. 而多色雙光子激發熒光顯微成像通過增加激光器或采用連續光譜的方法， 可以實現對多色標記的細胞或蛋白質的同時成像和動態追蹤. 另外， 2PEF 雖然能對樣品進行高分辨率成像， 但其獲得的僅僅是熒光強度信號， 信息維度有限， 雙光子激發熒光壽命顯微成像通過探測熒光壽命信息， 可以在進行高分辨三維成像的同時獲取生物組織的生化特性信息. 此外，2PEF 在生物醫學成像的應用常局限在細胞、離體樣品或者活體表層， 難以進行體內深層器官組織成像， 雙光子光纖內窺成像通過減小系統尺寸， 能將成像延伸到活體內深處組織， 提供了低侵入性的解決方案. 在進行活體腦功能成像時， 2PEF 雖然可以通過增加波長來減少組織散射， 但最終成像深度受限于信號背景比為1 的條件[3]， 而三光子顯微成像技術通過將波長拓展到1600 nm 到1820 nm，在該波長范圍內激發光的衰減最小， 由此在活體腦成像時能獲得更高的成像深度和信噪比. 可見， 多色雙光子激發熒光顯微成像、雙光子光纖內窺成像、雙光子激發熒光壽命顯微成像和三光子顯微成像技術這幾種多光子成像技術能大大拓寬傳統2PEF 的生物醫學應用范圍， 具有極大的發展潛力.本文簡要介紹了這幾種多光子成像技術的成像原理及其生物醫學應用， 最后對其未來發展趨勢進行展望.

2 多色雙光子激發熒光顯微成像

監測人體微環境中細胞、蛋白質、DNA 等動態特性和相互作用， 對于活體成像和免疫治療等研究具有重大意義. 多色熒光顯微成像使用具有不同發射光譜的熒光團標記不同的細胞、蛋白質、DNA等， 通過熒光團的光譜信息區分標記樣品的類型和功能， 從而實現對多種標記物的動態追蹤[4]. 在共聚焦成像中， 單光子多色成像通常采用一個波長激發多種標記物， 但是由于熒光團的單光子激發光譜較窄， 不同熒光團的激發光譜可能相差很大， 所以一個波長難以激發多種熒光團[5]. 相比之下， 常見的熒光團的雙光子激發光譜更寬[6]， 不同熒光團激發光譜重疊可能性大， 故多色雙光子激發熒光顯微成像更容易實現. 圖2 所示為典型的激光掃描多色雙光子激發熒光顯微成像系統.

針對多色標記熒光團的實時動態監測， 需要同時有效地激發多色熒光標記物， 并且在成像時快速區分熒光標記物所標記的細胞、細胞器或蛋白質等. 由于許多熒光物質的雙光子吸收光譜較單光子吸收光譜要寬， 光譜重疊較高， 所以用單一波長的光源也可以同時激發多種熒光團， 實現多色雙光子激發熒光顯微成像， 但熒光團的最佳激發波長往往不一致， 單一波長的光源無法實現最優激發， 且當熒光團本身雙光子吸收截面較小時， 為了獲取多種熒光團的熒光信號， 往往需要增加功率來提高熒光強度， 這會引起光毒性和產生光漂白效應. 此外，增加激光功率也會使細胞產生內源性自發熒光， 其與所用熒光團發射的熒光可能存在光譜重疊現象，這種光譜串擾會影響對于標記細胞或蛋白質的動態監測.

圖2 激光掃描多色雙光子激發熒光顯微鏡系統示意圖. 圖中各部分為： Femtosecond Laser， 飛秒激光器； Optical isolator， 光隔離器； Mirror， 反射鏡； HWP (half-wave plate)， 半波片； Lens， 透鏡； PCF (photonic crystal fiber)， 光子晶體光纖； FL (fiber launcher)， 光纖耦合器； Filter， 濾光片； Scanners， 掃描振鏡； DM (dichroic mirror)， 二向色鏡； PMT (photomultiplier tube)， 光電倍增管探測器； Monochromator， 單色儀； Obj (objective)， 物鏡Fig. 2. Schematic diagram of laser scanning multicolor two-photon fluorescence microscope system. The abbreviations in the figure are as follows： HWP， half-wave plate； PCF， photonic crystal fiber； FL， fiber launcher； DM， dichroic mirror； PMT， photomultiplier tube； Obj， objective.

為了實現多種熒光團的同時最優激發， 提升多色雙光子激發熒光顯微成像的信號強度， 可以采用多個波長或寬帶光譜的激發光源. 前一種方法的實現可以采用兩個或兩個以上的飛秒激光器作為多波長激發光源[7]， 或采用拓展激發光的光譜波段的方法， 如光參量振蕩器(optical parametric oscillator，OPO)[8]. 利用鈦藍寶石振蕩器作為抽運源， 可以使OPO 輸出1200 nm 以上的近紅外波段范圍內連續調諧的超短脈沖激光. 然而， 增加光源的成本很高， 成像光路也會由此變得復雜， 限制了這種多激勵源技術在多色雙光子激發熒光顯微成像上的應用. 后一種方法是利用寬帶可壓縮的連續光譜脈沖來實現多色雙光子激發熒光顯微成像， 主要包括兩種： sub-20 fs 激光器發射的寬譜脈沖[9]和基于100 fs 激光器產生的光纖連續光譜[10]. sub-20 fs 激光器產生的短脈沖具有100 nm 以上相位穩定的光譜帶寬. 通過脈沖整形引入的相位函數改變該脈沖光譜的相位相干性， 從而改變脈沖頻率， 進一步提升熒光團的雙光子激發效率， 實現對應熒光團的選擇性激發. 該方法無需調節光路來選擇激發波長， 但系統同樣復雜， 且需要特定的激光器. 而采用光纖產生超連續光來實現多色雙光子激發熒光顯微成像則只需常用的100 fs 激光器， 其原理是利用激光器的飛秒脈沖在光纖中的非線性傳輸特性，結合脈沖壓縮技術產生寬帶光譜、短脈寬的飛秒脈沖. 該技術不僅能實現多色雙光子熒光團的最優激發， 還能顯著提升雙光子激發熒光的效率. 早期的連續光譜是用激光在普通單模光纖的正常色散區傳輸產生的[11]， 但光源系統十分復雜. 而目前人們則采用具有零色散點的光子晶體光纖(photonic crystal fiber， PCF)來產生連續光譜. 利用孤子效應可以產生較寬光譜范圍的連續光譜， 且選擇合適的PCF 的參數可有效控制零色散點的位置. 但由于孤子效應通常發生在PCF 的反常色散區， 因而其產生的連續光譜對振動和噪聲十分敏感， 即使是很微弱的振動也會使光譜結構發生極大變化， 光譜相干性劇烈下降. 因此， 設計更為簡單的系統來實現多種熒光團的同時最優波長激發， 同時在一定程度上保證雙光子激發效率和避免光譜串擾問題， 仍是多色雙光子激發熒光顯微成像技術發展的重要方向.

多色雙光子激發熒光顯微成像技術在癌癥診斷方面發揮著重要作用. 在早期的疾病診斷與病理學研究中， Li 等[12]通過采用PCF 產生波長范圍為600—700 nm 的連續光譜激發細胞內源性熒光，對細胞內的NADH 和色氨酸成像. 以色氨酸的熒光作為參考， 對比色氨酸與NADH 兩者的信號強度， 從而實現正常細胞與癌細胞的區分， 繼而通過研究細胞代謝活性與蛋白質的表達， 實現非侵入性癌癥診斷. 此后， Li 等[13]還使用OPO 技術來獲得超短飛秒脈沖， 在600 nm 波段進行雙光子激發，并通過對NADH， FAD 和色氨酸的多色雙光子熒光成像， 成功地檢測了皮膚癌癥炎癥. Le Dévédec等[14]采用多色雙光子激發熒光顯微成像來實現誘導基因表達， 利用小鼠模型研究了乳腺癌細胞群體的轉移行為. 其結果證明了該系統可用于研究個體候選轉移基因在體內外的作用， 并在研究癌癥轉移中的細胞事件也可發揮作用. Entenberg 等[15]利用兩個鈦藍寶石激光器， 對用CFP， EGFP， TagRFP657等熒光蛋白標記的小鼠乳腺癌腫瘤細胞實現多色雙光子熒光成像. Piatkevich 等[16]開發了兩種紅色熒光蛋白LSS-mKate1 和LSS-mKate2， 它們具有較大的斯托克斯位移， 激發/發射最大值分別在463/624 nm 和460/605 nm. 通過將這些熒光蛋白應用于乳腺癌的小鼠異種移植模型進行多色雙光子激發熒光顯微成像， 該小組觀察到乳腺癌細胞在活體小鼠血管中顯示出明顯的極化作用， 其成像結果如圖3 所示.

圖3 NLS-LSS-mKate1 標記細胞核(紅色)和GalT-ECFP標記高爾基(藍色)的腫瘤細胞的多色雙光子激發熒光顯微成像[16]. 比例尺： 10 μmFig. 3. Multicolor two-photon excited fluorescence microimaging of tumor cells with NLS-LSS-mKate1 labeled nucleus (red) and GalT-ECFP labeled Golgi (blue)[16]. Scale bar： 10 μm.

如今， 多色雙光子激發熒光顯微成像已被越來越多地應用到神經科學領域研究中， 可實現在亞細胞水平記錄生命活動信息. Collot 等[17]開發了用于細胞和組織中脂質滴的多色成像的超亮熒光探針， 實現了對小鼠肝臟的多色雙光子激發熒光顯微成像. Garaschuk 等[18]通過在小鼠腦內注射多種染料混合物并進行多色成像， 可得到小鼠大腦表面500 μm 處不同神經元及神經膠質細胞的成像， 該方法適用于不同物種的各個發育階段腦組織染色，還能對進行活體實時鈣信號記錄. Hayakawa 等[19]發現當細胞質中游離的Ca2+濃度超過15 μmol/L時會立即誘導線粒體去極化， 這個過程與線粒體中NADH 的氧化有關. 通過采用多色雙光子顯微成像來表征單個神經元中的線粒體反應， 實現了對小鼠神經元中的單個線粒體的多色熒光顯微成像，證明了哺乳動物中樞神經元中線粒體去極化介導的快速的Ca2+依賴性的氧消耗. Mahou 等[20]利用飛秒激光器與OPO 產生的同步脈沖， 實現了具有不同吸收光譜的3 個熒光團的多色雙光子激發熒光顯微成像. 利用熒光團來標記細胞， 實現了小鼠腦組織的實時多色成像及果蠅胚胎中的多色熒光與三次諧波成像. 2014 年， Mahou 等[21]又將先前的工作進行了拓展， 將雙光子光片照明與混合波長激發相結合， 實現了用28 MHz 像素速率來記錄斑馬魚胚胎中跳動心臟的四維多色熒光顯微成像， 且光漂白幾乎忽略不計. 2017 年， 該團隊利用波長混合(wavelength mixing)技術， 對NADH 和FAD這兩種內源性熒光團實現高效雙色雙光子成像， 同時結合雙光子激發熒光壽命成像技術對人皮膚和線蟲中NADH 和FAD 的壽命梯度進行重建[22]. 隨后，2019 年， 該團隊又提出彩色多光子串行顯微鏡(chromatic multiphoton serial microscopy， ChroMS)[23]，

通過波長混合技術將三色雙光子激發與自動連續組織切片結合， 能達到微米級分辨率的多色成像效果， 由此還實現了小鼠腦內的三維多色成像. 圖4展示了用ChroMS 對小鼠皮層組織進行連續三維成像的結果.

隨著熒光探針和激光光源技術的不斷發展， 多色雙光子激發熒光顯微成像技術也在生物醫學中得到越來越多的應用. 而與其他光學成像技術的結合， 如光片顯微技術、熒光壽命成像顯微技術(fluorescence lifetime imaging microscopy， FLIM)等，能不斷拓寬多色雙光子激發熒光顯微成像技術的功能及應用領域. 未來隨著超短脈沖激光器和信號探測技術的不斷發展， 多色雙光子激發熒光顯微成像技術將會具有更好的應用前景.

3 雙光子激發熒光壽命成像

熒光壽命是指當組成物質的分子在受到光脈沖的激發躍遷到高能級后， 回到基態前在激發態的平均停留時間， 大約為ns 量級， 常用τ表示[24]. 熒光壽命是熒光物質的自身屬性， 通常與激光的激發強度、光照時間和染料濃度等因素無關， 而與物質自身所處微環境及其本身的結構等條件有關. 由于熒光壽命是熒光分子的固有性質， FLIM 技術可以提供比強度、光譜更清晰的熒光染料標記， 并且它包含關于熒光標記的局部分子環境和發色團光物理學的信息， 因此， FLIM 技術在成像時具有特異性強和靈敏度高的優點， 能增強生物樣品的圖像對比度， 而且還可以獲取熒光分子所在的微環境中的物理、化學及生物信息. 該技術目前已成為生物學、生物物理學和生命科學領域中研究樣品生化性質的有力工具.

圖4 小鼠皮層組織的連續三維多色成像[23]Fig. 4. Continuous three-dimensional multicolor imaging of mouse cortical tissue[23].

測量熒光壽命的方法主要包括頻域法和時域法[25]. 頻域法又稱相位調制法， 主要有外差法和零差法. 如圖5(a)所示， 它利用強度按正弦規律調制的激光激發樣品， 從而使得樣品發出的熒光強度也具有相同的正弦調制頻率. 通過測量熒光和激發光之間的解調系數及兩者之間的相位差Δφ后可以計算得到熒光壽命值. 而時域法， 也稱作脈沖法， 主要有時間相關單光子計數法(time-correlated single photon counting， TCSPC)、門控探測法(timegated detection)和條紋相機測量法(streak camera)3 種實現方式. 時域法測量熒光壽命的方法是利用超短脈沖光源來激發被測樣品， 以測量出樣品熒光強度的時間衰減規律， 再通過計算或擬合得到壽命[26]. TCSPC 是目前測量熒光壽命最常用的方法，如圖5(b)所示， 其原理是通過記錄激發脈沖過后首個熒光光子到達探測器的時間， 并記錄到對應的時間通道中， 多次重復建立一個正比于熒光衰減曲線的光子數-時間分布直方圖. 常見的頻域法及TCSPC 法測量熒光壽命的原理及雙光子TCSPC-FLIM成像系統如圖5 所示.

雙光子FLIM 是將雙光子成像技術與FLIM技術的結合， 可獲取生物組織的生化特性信息， 同時進行高分辨三維成像， 實現功能和結構的精確定量表征. 兩種技術結合的特點在于： 1) 雙光子FLIM使用的激發波段較長， 穿透深度更大， 能夠獲取生物樣品深層的熒光壽命信息； 2) 雙光子顯微成像技術使用的是脈沖激發光源， 熒光激發效率高， 能滿足熒光壽命探測的需要， 而雙光子顯微成像所固有的層析能力， 能在測量厚樣品時避免不同深度信號之間的干擾[27]. 可見， 將雙光子成像技術與FLIM技術結合， 拓寬了熒光信息探測模式的維度， 具有廣闊的應用前景， 能為生物醫學領域提供強有力的研究手段.

圖5 常見的熒光壽命測量方法及雙光子TCSPC-FLIM 成像系統示意圖 (a) 頻域法； (b) TCSPC 法； (c) 基于TCSPC 的雙光子FLIM 成像系統示意圖. 圖中各部分為： Femtosecond Laser， 飛秒激光器； BS (beam splitter)， 分光鏡； Scan Lens， 掃描鏡； Tube Lens， 鏡筒透鏡； DM (dichroic mirror)， 二向色鏡； Obj (objective)， 物鏡； Filter， 濾光片； PMT (photomultiplier tube)， 光電倍增管探測器； Reference Beam， 參考光； PD (photodiode)， 光電二極管； TCSPC， 時間相關單光子計數法Fig. 5. Schematic diagram of common fluorescence lifetime measurement methods and imaging systems： (a) Frequency domain method； (b) TCSPC method； (c) schematic diagram of a two-photon FLIM imaging system based on TCSPC. The abbreviations in the figure are as follows： BS， beam splitter； DM， dichroic mirror； Obj， objective； PMT， photomultiplier tube； PD， photodiode； TCSPC， time-correlated single photon counting.

與傳統基于熒光強度的活體成像方法相比， 雙光子FLIM 技術可以提供更多的生化和醫學診斷信息. 目前用雙光子FLIM 技術監測細胞組織的代謝狀態常用的手段是對NADH 和FAD 等內源性熒光標記物進行壽命信息探測. 表1 給出了雙光子FLIM 監測NADH 和FAD 的工作原理.

在腫瘤的形成和發展過程中， 細胞的代謝情況也會發生相應變化. 與正常細胞相比， 癌變前細胞中的NADH 和FAD 的熒光壽命及氧化還原比存在較大差異[29]. NADH 的生化特性對于確定細胞代謝活性至關重要. 利用雙光子FLIM 測量游離或結合蛋白質的NADH 的熒光壽命有助于我們推導細胞內氧化還原的狀態， 這已成為分析診斷癌癥的一種有效工具. Anh 等[30]發現與普通的二維的細胞培養方法相比， 在三維的膠原蛋白基質中培養的癌細胞中NADH 壽命更長， 原因在于三維培養時更多的NADH 與酶結合， 此外該團隊還對比了二維和三維培養形式下的4T1 細胞對靶向線粒體和氧化磷酸化途徑的新型MCT 抑制劑(MD1)和TPPBr的代謝反應. 深圳大學屈軍樂教授課題組[31]開展了雙光子FLIM 技術的生物醫學應用研究， 已將該技術與腫瘤的機理與診斷方法研究結合起來， 取得了初步的進展. 2019 年， 該團隊利用雙光子FLIM技術從基底細胞癌切片中提取熒光壽命信息， 構建了LSVM 模型， 能更精確評估皮膚癌癥的發展階段[32]. 之后， 該團隊又將共聚焦、雙光子、FLIM 技術相結合構建了多模態成像系統[33]， 可快速得到生物樣品中的諧波及壽命信息. 如圖6 所示， 通過將FLIM 與相量分析法結合， 該團隊揭示了肝癌切片中癌轉移的能量代謝變化. 另外， 前列腺癌是男性的主要癌癥之一， 目前仍缺乏能夠預測前列腺癌治療反應的實驗方法. 而癌癥中的線粒體功能障礙(如缺陷性氧化磷酸化)通過調節活性氧(reactive oxide species， ROS)產生和細胞信號傳導來抑制細胞凋亡提供了前列腺癌的評估手段， 其糾正和凋亡的誘導是癌癥治療的可行方法之一. 據此， Alam等[34]利用FLIM 測量NADH， FAD 及色氨酸(Trp)三者及其與酶結合部分的壽命來定量描述前列腺癌細胞中的線粒體代謝反應， 并評估抗癌藥阿霉素對前列腺癌細胞的作用. 在治療之后， NADH 與酶結合的壽命貢獻增加， 而FAD 與酶結合的壽命貢獻減少， 通過FLIM 分析推斷NADH/FAD 和細胞內ROS 的氧化還原比增加， 隨后誘導了細胞凋亡活性. 腦腫瘤也是常見的癌癥之一， 由于腦腫瘤無明顯邊界， 在切除腫瘤組織時容易傷及正常腦區域， 腫瘤難以徹底切除. FLIM 由于具有高特異性和非侵入性等優點， 已逐漸成為腦腫瘤研究的熱點之一. Poulon 等[35]通過對人腦腫瘤樣品的內源性熒光團進行分析， 證實了雙光子FLIM 具有分辨腫瘤與非腫瘤腦組織及腫瘤轉移的能力. Kantelhardt等[36]首次將雙光子FLIM 應用到膠質母細胞瘤的手術成像中， 該團隊在活體中觀察發現了蛛網膜和實體瘤組織的顯微結構和熒光壽命存在差異， 證明了雙光子FLIM 技術用于腦腫瘤檢測的潛力. 在口腔癌研究中， Teh 等[37]通過建立二甲基苯并蒽誘導的倉鼠頰囊黏膜癌模型， 同樣基于NADH 和FAD，從細胞代謝角度出發， 證實了雙光子FLIM 技術具有分辨口腔癌及其他早期癌癥癌前病變的能力.Rück 等[38]從能量代謝角度研究人口腔黏膜細胞，發現相比正常細胞， 惡性的口腔黏膜細胞平均熒光壽命更長， NADH 含量降低. 除NADH 和FAD 外，研究人員也在積極進行其他內源性熒光團的研究，如Shen 等[39]通過雙光子FLIM 技術對內源性膽紅素的熒光壽命信息進行口腔癌的檢測研究， 研究表明口腔癌細胞中的膽紅素熒光壽命更長. 在胃癌研究中， Li 等[40]用雙光子FLIM 對新鮮人胃竇黏膜的胃癌樣本進行成像， 結果表明通過熒光壽命可以清晰分辨健康胃黏膜與癌癥區域的亞結構， 包括表皮結構、固有層、胃癌的間質組織及粘液上皮細胞、杯狀細胞等多種細胞類型， 通過提取子結構的光譜和壽命信息， 還能區分胃癌的多個階段.

表1 雙光子FLIM 監測NADH 和FAD 的工作原理[28]Table 1. Working principle of NADH and FAD monitoring by two-photon FLIM[28].

圖6 利用雙光子FLIM 技術揭示肝臟切片上的癌癥轉移[33]Fig. 6. Using two-photon FLIM technology to reveal cancer metastasis on liver slices[33].

雙光子FLIM 技術也逐漸成為神經科學領域研究的有力工具之一. 阿爾茲海默癥是一種神經系統退行性疾病， 其發病機理被認為與淀粉樣蛋白(Aβ)有關. Tyurikova 等[41]用雙光子FLIM 技術結合膜片鉗電生理學監測腦切片中星形膠質細胞和神經元中的Ca2+濃度， 發現在切片中注射亞微摩爾的Aβ 會引發相鄰星形膠質細胞中Ca2+濃度顯著提高， 該現象反映Aβ 對于腦細胞生理作用存在一定影響. 之后該團隊又采用雙光子FLIM 技術對鈣離子熒光指示劑OGB-1 成像[42]， 開發了一種監測單細胞內Ca2+離子的方法， 在腦切片與原位神經細胞上證明了該方法具有更高的信噪比與靈敏度. Feeks 等[43]將自適應光學與雙光子FLIM結合， 對小鼠視網膜中的非固有熒光團進行成像，如圖7 所示. 通過在小鼠模型中使用遺傳編碼的鈣指示劑， 觀測雙光子自發熒光和熒光壽命的變化，可以探測多種功能反應. 這項研究還為分子靶向的進一步應用和疾病進展的研究打開了大門， 通過觀察視網膜的熒光壽命變化， 可以為患有糖尿病性視網膜病和斯塔加特病的較早階段患者檢測疾病進展. 帕金森氏癥是目前最困擾人類的病癥之一， Chakraborty 等[44]通過雙光子FLIM 研究神經元細胞中NADH 和FAD 的熒光壽命成分， 以及在MPP+(1-甲基—4 苯基吡啶)處理后壽命的變化. 該團隊發現， 在經MPP+處理的細胞中， 游離和結合蛋白的NADH 及游離和結合蛋白的FAD 的熒光壽命都有統計學上的顯著降低. 這些結果表明， 在MPP+處理的細胞中能量產生從氧化磷酸化向厭氧糖酵解的轉變， 這可以潛在地用作細胞代謝指標， 以評估細胞水平上帕金森氏癥的情況.

圖7 小鼠視網膜毛細血管成像[43] (a) 雙光子熒光強度圖像； (b) 圖7(a)中的局部血管； (c) 圖7(b)對應的熒光壽命圖像. 比例尺： 25 μmFig. 7. Imaging of mouse retinal capillaries[43]： (a) Two-photon fluorescence intensity image； (b) local blood vessel in Fig.7 (a)； (c) fluorescence lifetime image corresponding to Fig.7 (b). Scale bar： 25 μm.

盡管雙光子FLIM 技術已經取得了一系列的研究進展， 但在實際應用中仍面臨著一些挑戰. 如：1)雙光子FLIM 技術系統較為復雜， 成本昂貴， 對激發光源和探測器都有著較高要求， 龐大昂貴的硬件系統限制了雙光子FLIM 技術在臨床醫學上的應用； 2) 雙光子FLIM 技術的穿透深度仍限制在幾百微米以內， 難以探測生物組織深層信息； 3) 雙光子FLIM 技術在數據采集與處理上都較為耗時，采集一張高分辨率的圖像往往要耗時幾秒甚至幾分鐘， 大大限制了該技術的應用. 未來隨著激發光源技術、信號采集及數據處理技術的進一步發展， 雙光子FLIM 技術的性能有望得到進一步的提升.

4 雙光子光纖內窺成像

傳統的2PEF 雖然能為我們提供生物細胞組織的清晰成像， 但由于其成像系統較復雜， 器件較多， 體積龐大. 并且在現階段， 大部分對于生物細胞組織的成像仍局限在離體細胞培養， 亦或是局限在生物體表層一定深度. 而生物體內的微環境十分復雜， 體內環境與離體環境差別巨大， 在離體環境下觀察得到的結果可能與體內環境相差甚遠. 而通過腹窗手術等方法[45]雖然可以實現活體的細胞組織成像， 但這些方法具有高侵入性， 對生物體損害較大， 也不能實現長時間的活體成像， 這些因素都限制了雙光子顯微鏡在活體成像中的應用. 隨著光纖內窺技術的不斷發展， 雙光子光纖內窺成像技術逐漸克服了傳統光學顯微鏡的物理限制， 為長時間活體成像提供了一種有效手段.

光纖內窺成像技術是將光纖或光纖束從管腔伸入活體內部組織器官的一種成像技術， 由于光纖體積小， 彎曲性好， 對生物體的侵入性較小， 使用上也比較便捷， 特別適合長時間活體內部成像. 該技術通過光纖導入激發光激發組織器官產生熒光，然后使用微型探頭收集熒光并傳遞到體外的光電探測器進行成像. 雙光子光纖內窺成像技術則是集合了2PEF 和光纖內窺成像兩者的優勢， 由于2PEF采用的波長較長， 在組織中的散射較少， 穿透能力更強， 與光纖內窺的結合能夠獲得更深組織的成像， 且圖像對比度也能有所提高[46]， 在活體成像領域具有良好的發展前景. 最早用于雙光子光纖內窺成像的光纖是單模光纖， Bird 和Gu 等[47]首次將單模光纖耦合器與2PEF 結合起來， 證明了單模光纖耦合器能傳輸近紅外波段的超短脈沖激發光并收集熒光. 但單模光纖在使用上存在缺點. 一是單模光纖具有自相位調制效應， 光纖色散系數也比較高， 飛秒脈沖經過單模光纖傳輸后會出現嚴重畸變， 脈沖會變寬， 使得在焦點處的熒光激發效率變低. 二是單模光纖的纖芯較小， 數值孔徑小， 熒光的收集效率比較低. 為了突破單模光纖帶來的局限， 人們開始采用PCF 來進行脈沖光的傳輸[48].相較于單模光纖， PCF 的光引導方式比較獨特， 比如現階段使用較多的雙包層光子晶體光纖(doubleclad photonic crystal fiber， DC-PCF)， 具有較大的模場半徑， 脈沖光的傳輸效率和熒光的采集效率都很高， 包層光纖還可并入管狀壓電致動器中， 實現雙光子光纖內窺系統的微型化. 此外， 光纖耦合器也是雙光子光纖內窺成像系統中的重要器件， 光纖耦合器可以實現光束在兩根甚至多根光纖之間的耦合傳輸， 將激發光和收集光進行分束， 使系統在結構上更加靈活簡便[49]. 圖8 為雙光子光纖內窺成像系統示意圖.

圖8 雙光子光纖內窺系統示意圖. 圖中各部分為： Femtosecond Laser， 飛秒激光器； FL (fiber launcher)， 光纖耦合器； PBF(photonic band-gap fiber)， 光子帶隙光纖； Mirror， 反射鏡； DM (dichroic mirror)， 二向色鏡； Lens， 透鏡； Filter， 濾光片； PMT(Photomultiplier tube)， 光電倍增管探測器； DAQ (data acquisition)， 數據采集； DCF (double-clad fiber)， 雙包層光纖； Endomicroscope Probe， 內窺鏡探頭Fig. 8. Schematic diagram of a two-photon fiber endoscopic system. The abbreviations in the figure are as follows： FL， fiber launcher； PBF， photonic band gap light； DM， dichroic mirror； PMT， Photomultiplier tube； DAQ， data acquisition； DCF， double-clad fiber.

隨著PCF 和微電機系統(micro-electro-mechanical system， MEMS)掃描器等技術的不斷發展，雙光子光纖內窺成像技術在成像速度、分辨率及系統體積等方面都取得了長足的進步. Tang 等[50]設計了使用雙軸MEMS 鏡和DC-PCF 的多光子內窺鏡系統， 其中MEMS 掃描儀反射鏡尺寸僅為2 mm， 掃描角度達到20°， 在x和y軸上的最大可分辨焦點數目為720 × 720， 采集得到了牛膝關節軟骨的多光子顯微圖像. Piyawattanametha 等[51]開發了一種基于MEMS 二維微型掃描儀的雙光子光纖微型內窺鏡， 重量僅為2.9 g， 可用于對活體小鼠大腦的微脈管系統的體內成像. 該團隊通過將光纖附著在活體小鼠的顱骨上來收集體內新皮層微血管的雙光子熒光圖像， 此外還可用于追蹤流過觀察血管的紅細胞. Wu 等[52]開發了一種緊湊的全光纖掃描內窺鏡系統， 用于生物樣品的雙光子熒光和二次諧波(second harmonic generation， SHG)成像. 通過對上皮組織和口腔組織的深度分辨雙光子熒光成像， 證明了該緊湊的全光纖非線性光學內窺鏡系統具有出色的成像能力， 有望用于實時評估腔內器官的上皮和基質結構. Lee 等[53]開發了一種更為緊湊的雙光子光纖內窺系統， 所有光學組件的尺寸均為1 mm， 成像頭重量僅為0.6 g， 并成功地將該系統應用到小鼠腦中樹突細胞的功能性鈣成像， 證實了該系統可用于清醒自由行為的動物的神經網絡動力學的光學記錄上.雙光子光纖內窺技術在臨床診斷與治療中也發揮著重要的作用. 2012 年Louradour 團隊[54]提出了激發波長可調的非線性光纖光譜儀， 波長調節范圍為700—900 nm， 脈沖寬度為70 fs， 可以通過彈性蛋白的雙光子信號和膠原蛋白的SHG 信號對離體人肺組織進行非線性光譜分析. 在2015 年，該團隊又基于DC-PCF 設計了尺寸僅為2.2 mm的雙光子光纖內窺鏡， 可以8 幀/s 的速度同時進行雙光子和SHG 信號的探測， 橫向和軸向分辨率分別為0.8 μm 和12 μm， 最大成像視場為450 μm×450 μm， 成像穿透深度可以達到器官表面以下300 μm， 是臨床上實時病理狀態評估的一種有力工具[55]. 雙光子光纖內窺技術在使用時會面臨兩個挑戰， 一是大多數生物內源性熒光團的雙光子吸收位于700—900 nm 的光學窗口， 而光纖在該窗口具有較大色散； 二是非線性自相位調制效應(self-phase modulation， SPM)會使得激勵信號的頻譜變寬， 導致信號失真. 該團隊通過引入一根標準保偏單模光纖(polarization maintaining singlemode fiber， PM-SMF)補償頻譜壓縮的非線性效應， 以及使用補償二階和三階色散的脈沖擴展器，能保證系統在5 m 長的光纖輸出端傳遞40 fs 以下的紅外激發脈沖. 此外通過設計定制純二氧化硅內核的DC-PCF 既能確保高空間分辨率， 還能保證飛秒脈沖在光纖傳輸中的性能不會因彎曲而產生偏振模色散. DC-PCF 設計示意圖如圖9(a)—(c)所示. 在內窺鏡輸出端， 該團隊用共振光纖掃描儀和微光學(micro-optics， MO)搭建了小型成像探頭， 將外徑控制在2.2 mm. 當給樣品施加5 mW功率時， 該系統能以8 幀/s 的高靈敏度對樣品進行成像， 圖9(d)—(k)展示了該系統在離體小鼠切片樣品及人體肺部切片樣品的成像效果. 通過調整輸入端半波片可選擇不同的正交線性極化， 當激發極化平行于膠原蛋白時， 可以獲取到更強的SHG信號.

對于內窺成像， 研究者們不僅想觀測生物體內的熒光強度信息， 同時也希望能夠獲取樣品的生化信息， 由此在2018 年， 該團隊又將雙光子內窺成像與FLIM 技術結合[56]， 利用DC-PCF 搭建了雙光子FLIM 內窺成像系統， 并首次實現了內窺鏡的NADH 壽命成像. Sibai 等[57]將雙光子內窺成像技術與FLIM 技術結合， 通過內窺鏡監測內源熒光團的強度、光譜和壽命特性等來研究大腦組織，其結果表明在恒定的平均激光功率條件下， 短至40 fs 的激發脈沖即使長時間照射組織也不會對組織的生化/生物物理特性產生不良影響.

在生物體器官內臟的研究診斷和治療中， 使用光學內窺鏡精確控制和操縱微米和納米顆粒也具有重要意義. Gu 等[58]首次展示了用于直接控制和操縱納米珠及金納米棒的光學非線性內窺鏡鑷子(optical nonlinear endoscopic tweezers， ONETs).與相同尺寸的介電納米珠相比， 雙光子吸收可以將熒光納米珠的捕獲力提高多達4 個數量級. 此外，雙光子激發會在納米棒上產生等離激元介導的光熱引力， 使納米棒快速上載到目標細胞， 在1 min內進行熱處理. 該工具在精確指定藥物顆粒的位置和劑量并將金屬納米顆?？焖偕陷d至單個癌細胞進行治療方面具有較好的應用前景.

圖9 用于雙光子內窺鏡的空氣-二氧化硅DC-PCF 設計及系統成像圖[55] (a) 光纖纖芯示意圖， 二氧化硅部分為灰色， 空氣部分為黑色； (b) 雙包層光纖纖芯截面示意圖； (c) DC-PCF 具有靈活性； (d)-(k) 組織樣本的無標記雙光子光纖內窺成像， 紅色為TPEF 信號， 綠色為SHG 信號. (d)， (e) 大鼠尾肌腱； (f) 鼠耳. D： 真皮； E： 表皮； IC： 內部軟骨； (g)健康人類肺部樣品(肺泡區域)；(h) 小鼠動脈； (i)-(k)健康人類肺部樣品里3 個位置的細胞外基質. 比例尺： 50 μmFig. 9. Design and system imaging diagram of an Air-silica DC-PCF for a two-photon endoscope[55]： (a) Schematic diagram of the optical fiber core， the silica part is gray， and the air part is black； (b) the cross-sectional schematic view of the double-clad fiber core； (c) DC-PCF is flexible； (d)-(k) Unlabeled two-photon fiber endoscopy imaging of tissue samples， red is TPEF signal， green is SHG signal； (d)， (e) rat tail tendon； (f) mouse ear. D： dermis； E： epidermis； IC： internal cartilage； (g) healthy human lung samples(alveolar regions)； (h) mouse arteries； (i)-(k) extracellular matrix at 3 locations in healthy human lung samples. Scale bar： 50 μm.

雙光子光纖內窺成像在體內組織器官定性與定量檢查時具有侵入性低、光損傷小、操作便捷等優勢， 是生物醫學領域中活體成像研究不可或缺的重要工具. 但目前雙光子光纖內窺成像仍面臨著如成像分辨率不高、系統尺寸較大、熒光收集效率低等許多技術挑戰， 隨著PCF 與MEMS 等技術的發展， 雙光子光纖內窺成像技術的性能將得到進一步提升， 從而在生物醫學領域中發揮更大的作用.

5 三光子顯微成像

目前， 多光子顯微成像技術已成為腦科學研究的重要工具之一， 為了探索大腦的奧秘， 研究者們在不斷尋求研究生物體腦內更深層信息. 在用2PEF 技術進行腦神經科學研究時， 由于腦內深層組織中散射現象嚴重， 成像深度受到限制. 盡管采用更長波長的光激發能進一步提高成像深度， 但當焦點處信號熒光強度與背景熒光強度一致時， 成像深度便達到極限. 在小鼠腦中成像深度大約止步于白質層， 很難再往下突破. 一些解決方法， 如插入光學探針， 則會對生物體大腦產生不可逆的傷害.為了能無損地對腦深層信息進行采集， 人們開始將目光轉移到三光子顯微成像技術上.

相較于2PEF， 三光子顯微成像具有以下優勢：1)常用的熒光蛋白的三光子激發波長更長， 通常為1600—1800 nm， 處于生物組織的最佳紅外通光窗口， 在生物組織的穿透效果更好； 2)三光子顯微成像作為更高階的非線性成像方法， 不僅具備雙光子顯微成像的光學切片能力， 同時抑制背景信號能力比雙光子顯微成像也有所提高. 圖10 為激光掃描三光子顯微鏡示意圖.

圖10 激光掃描三光子顯微鏡示意圖. 圖中各部分為： Fiber Laser， 光纖激光器； HWP (half-wave plate)， 半波片； PBS (polarization beam splitter)， 偏振分束器； Mirror， 反射鏡； Lens， 透鏡； PCF (photonic crystal fiber)， 光子晶體光纖； Scan Mirror， 掃描鏡； Scan Lens， 掃描透鏡； Tube Lens， 鏡筒透鏡； DM (dichroic mirror)， 二向色鏡； Filter， 濾光片； Obj (objective)， 物鏡； PMT (photomultiplier tube)， 光電倍增管探測器Fig. 10. Schematic diagram of a laser scanning three-photon microscope. The abbreviations in the figure are as follows： HWP， halfwave plate； PBS， polarization beam splitter； PCF， photonic crystal fiber； DM， dichroic mirror； Obj， objective； PMT， photomultiplier tube.

早在1996 年， 美國Cornell 大學Xu 等[59]便利用鈦寶石鎖模飛秒激光器實現了1700 nm 波段的三光子成像. 之后該課題組一直從事三光子成像的研究. 2013 年， 為了研究小鼠腦內深層結構成像， 該團隊利用孤子自頻移(soliton self-frequency shift， SSFS)方法在光子晶體棒中開發了一種新的高脈沖能量源[60]， 輸出孤子能量為67 nJ. SSFS 效應是指在光纖中一個孤子通過脈沖內受激拉曼散射連續地將能量從高頻轉移到低頻. 提高光纖激光器的激光功率可以使波長往長波方向調諧. 當入射光脈寬越小時其孤子自頻移效應越強. 此外， 考慮活體小鼠腦內組織散射及吸收， 1700 nm 波段是最佳波長窗口， 圖11(a)展示了基于米氏散射和吸收率的組織模型衰減譜. 基于此， 該團隊將高能光纖激光器的1550 nm 波長移到所需的1700 nm 窗口， 搭建了一臺三光子熒光顯微成像系統， 測得孤子脈沖寬度為65 fs， 脈沖寬度壓縮了6 倍， 獲得的67 nJ 孤子能量也是當時最高. 在1700 nm 波段實現了對完整小鼠腦內皮質下結構的非侵入性、高分辨率的活體成像， 同時對小鼠海馬體內的血管結構及紅色熒光蛋白標記的神經元進行解析， 成像深度分別能達到1400 μm 和1200 μm， 成像效果如圖11(b)和圖11(c)所示.

2015 年， 該團隊提出了一種緊湊且便攜的三光子梯度折射率內窺鏡， 對沒有染色的小鼠肺進行了離體成像， 證實該系統可實現光學活檢的可行性[61]. 2014 年， 該團隊使用基因編碼的鈣指示劑，用三光子顯微鏡在1300 nm 波長激發下對成年小鼠皮質的GFP 標記的神經元進行體內成像， 展示了皮質第6 層(L6)深度的神經元活動[62]. 2015 年，該團隊利用硅晶片對1700 nm 激發的三光子顯微鏡的色散進行補償， 使得脈沖寬度減小了1/2 以上， 極大地提高了熒光激發效率， 從而實現三光子信號的4 倍增強效果， 并且展示了在小鼠腦表面以下900 μm 處該信號增加的現象[63]. 2017 年， 利用功能性成像的GCaMP6 s 標記的神經元， 該團隊使用三光子顯微成像技術在1300 nm 波段實現了在完整小鼠大腦中1 mm 深度的海馬錐體層中記錄多達150 個神經元的自發活動， 該方法在無損記錄腦組織深處的高時空分辨率的神經元活動方面具有非常大的潛力[64]. 2018 年， 該團隊開發了一種自適應飛秒激光源， 能夠把小鼠大腦中多光子成像速度提高10 倍以上， 在700 μm 深度下成像時可達到30 幀/s[65]. 同年該團隊又實現了透過小鼠顱骨下500 μm 深度處的脈管系統的三光子成像， 以及活體小鼠的皮質層中GCaMP6 s 的鈣成像[66].2019 年， 該團隊又對自適應飛秒激發源進行了改進， 可以僅激發感興趣的區域， 使得對活體小鼠腦成像的多光子成像功率要求降低30 倍， 使得高速縱向神經成像成為了可能[67]. 2020 年， 該團隊對小鼠腦中1300 μm 處的深層組織進行三光子鈣成像，并實現了定量分析. 此外還用三光子顯微成像以細胞分辨率對成年斑馬魚頭部深至小腦和視神經頂的部位進行結構和功能成像[68].

圖11 小鼠組織模型衰減譜及活體成像[60] (a) 基于米氏散射和吸水率的組織模型的衰減譜； (b) FVB/N 小鼠腦血管三光子圖像的三維重構； (c) B6.Cg-Tg(Thy1-Brainbow1.0)HLich/J 小鼠腦內神經元三光子圖像的三維重構Fig. 11. Attenuation spectrum and in vivo imaging of mouse tissue model[60]： (a) Attenuation spectrum of tissue model based on Mie scattering and water absorption； (b) three-dimensional reconstruction of three-photon image of FVB/N mouse cerebrovascular； (c) B6.Cg-Tg (Thy1-Brainbow1.0) three-dimensional reconstruction of three-photon images of neurons in the brain of HLich/J mice.

浙江大學錢駿教授課題組一直致力于三光子腦成像熒光探針的開發. 2015 年， 該團隊將金納米棒作為造影劑， 在1000 nm 波長激發下， 實現了小鼠腦內760 μm 的成像深度[69]. 為了減輕長期光照導致的熒光探針的光漂白， 該團隊還合成了一種具有聚集誘導發射(aggregation-induced emission，AIE)特性的光穩定型發光劑TPE-TPP， 在1020 nm波長激發下的三光子成像中表現出較小的光損傷[70].2016 年， 該組開發的AIE 熒光探針TTF 在很寬的pH 值范圍內化學性質都比較穩定， 結合該探針該團隊用三光子熒光顯微鏡監測了斑馬魚標記胚胎的不同生長階段， 追蹤時間可長達120 h[71].2017 年， 該團隊開發的1550 nm 波長激發的具有較大三光子吸收截面的AIE 探針可實現穿透顱骨的三光子熒光成像， 成像深度可達到顱骨下方300 μm，在該深度還可以識別出2.4 μm 的小血管[72]. 同年，該團隊用AIE 熒光探針實現了875 μm 深的小鼠大腦血管成像， 是當時基于AIE 熒光探針的三光子成像的最大深度[73]. 2018 年， 該團隊設計了基于熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer， FRET)的納米粒子， 由AIE 染料和NIR染料組成， 該粒子具有增強的三光子近紅外吸收能力[74]. 盡管三光子顯微成像技術能獲得深層組織中的熒光信息， 但在深層組織成像時， 三光子熒光信號仍然較弱， 難以探測， 而FLIM 技術探測的壽命信息卻幾乎不受光強影響. 于是， 該團隊于2019 年嘗試將三光子顯微成像技術與FLIM 技術結合， 以實現小鼠腦部的三光子FLIM 成像， 成像深度達到600 μm， 并且可分辨出1.9 μm 的毛細血管[75]，成像效果如圖12 所示. 2020 年， 該團隊又合成了量子產率高達42.6 %的AIE 熒光探針， 且第一次用三光子成像技術實現了對完整頭骨鼠腦中風過程高穿透深度和高對比度的成像結果， 該研究極大地推動了活體大腦的非侵入性熒光成像的發展[76].

深圳大學王科教授課題組致力于提高三光子熒光成像的穿透深度. 2017 年， 該團隊嘗試用二氧化氘( D2O )代替水作為浸入介質， 以提高1700 nm窗口處的透射率[77]. 之后又將硅油作為 D2O 的替代物， 比 D2O 在小鼠白質層的三光子信號提高了17%[78]. 2019 年， 該團隊利用量子點Qtracker655在活體小鼠腦部進行成像， 成像深度達到腦表面以下2100 μm， 且成像速度比之前提升了10 倍， 還可以對腦表面下1600 μm 處血管的血流速度進行測量， 這是目前世界上最深的活體小鼠多光子腦成像深度， 以及采用多光子成像技術進行血流速度測量的最大深度[79]， 成像結果如圖13 所示. 2020 年，該團隊又提出可以通過光子晶體中的SSFS 效應產生更多的高能孤子， 在小鼠皮質層中發現圓極化孤子激發的三光子熒光信號比線極化高出3.7 倍[80].

與2PEF 類似， 三光子顯微成像在功能成像方面也面臨著諸多挑戰. 科研人員也開始嘗試將三光子顯微成像與其他技術結合， 拓展三光子顯微成像的應用. Weisenburger 等[81]將三光子顯微成像與體成像技術結合， 開發了HyMS (hybrid multiplexed sculpted light microscopy)技術， 可以在17 Hz頻率下對12000 個神經元鈣信號進行單細胞分辨成像， 成像體積可達到1 mm×1 mm×1.22 mm，并成功地將該系統應用到小鼠聽覺皮層、后頂葉平層和海馬成像中. Klioutchnikov 等[82]設計了一種頭戴式三光子顯微鏡， 可以對運動大鼠1320 μm深的皮質神經元活動進行成像， 穩定成像時間超過1 h. 該團隊設計的空心光子帶隙晶體光纖(hollow-core photonic bandgap crystal fiber， HC-PBGF) 可以避免光纖彎曲引起的脈沖變化對分析神經元活動的影響， 采用的雙通道雙棱鏡序列和可變厚度的體硅結合還能減少群速度畸變和三階色散.

圖12 活體小鼠腦血管的三光子FLIM 成像[75]Fig. 12. Three-photon FLIM imaging of cerebral blood vessels in living mice[75].

圖13 活體小鼠三光子腦血管成像圖， 2100 μm 的成像深度為目前最深[79]Fig. 13. Three-photon cerebrovascular imaging of living mice. The imaging depth of 2100 μm is currently the deepest[79].

由于信號背景比的限制， 2PEF 技術在腦科學研究中能達到的成像深度具有一定局限性， 高階的三光子顯微成像技術由于可實現更高的成像深度，因而在研究生物腦內深層組織的構造及生理功能方面發揮著巨大的作用. 目前三光子顯微成像技術的應用主要受限于光源能量及熒光探針的三光子吸收截面等因素. 未來隨著光纖技術的發展， 光源技術的突破， 熒光探針技術的進步及弱光信號探測技術的改進， 三光子顯微成像技術將在腦科學研究中發揮更大的潛力.

6 總結與展望

近年來， 多光子成像技術以其高空間分辨率、高穿透深度、低侵入性， 以及固有的光學層析能力等優點， 在生物醫學領域已經取得了令人矚目的成果. 傳統的2PEF 發展已較為成熟， 為了取得進一步突破， 多光子成像技術從實際的生物醫學應用出發， 對傳統2PEF 在多色成像、功能成像、活體成像、成像深度等方面的不足進行了較大改進， 例如多色雙光子激發熒光顯微成像能在亞細胞水平實現多種標記熒光團的實時動態監測； 雙光子FLIM技術可以在進行高分辨三維成像的同時獲取生物組織的生化特性信息， 對生物組織功能和結構進行無標記精確定量表征； 雙光子光纖內窺成像能深入體內進行深層組織器官成像， 且相較于普通內窺鏡有著較高的分辨率， 能觀察到生物組織內亞細胞結構； 三光子熒光顯微成像相較2PEF 穿透深度更深， 分辨率及信噪比也大大提高. 總之， 相比于傳統2PEF， 這幾種多光子成像技術在成像性能方面得到極大提升， 顯著地拓寬了其在生物醫學領域的應用范圍. 然而， 受限于激光器、光纖、探測器等技術的發展， 多光子成像技術在生物醫學領域的應用仍面臨著巨大挑戰. 例如， 多色雙光子激發熒光顯微成像技術存在系統復雜， 多種熒光團無法同時最優激發、雙光子激發效率不高及光譜串擾等問題；雙光子FLIM 技術則與2PEF 技術相同， 也面臨著穿透深度依舊受限的問題， 而且雙光子FLIM系統較為復雜， 對光源和探測器等有嚴格要求， 成本昂貴. 再者， 受組織自身熒光信號強度和系統探測效率的限制， 雙光子FLIM 技術在數據的采集及處理上也十分繁瑣耗時； 雙光子光纖內窺成像雖然在向更小型化發展， 但對于活體內部組織器官實時成像而言系統尺寸仍不夠小， 而且在探測上對樣品發射的熒光的收集效率并不高； 三光子顯微成像技術成像深度則是受限于光源能量不高， 而且目前用于三光子熒光顯微成像的熒光探針數量較少， 且亮度有限. 未來隨著激光技術的發展和光源能量利用的進一步提升， 多色雙光子激發熒光顯微成像、雙光子FLIM 和三光子熒光顯微成像的激發效率與成像深度也會得到進一步提高； 而光纖技術在信號傳輸、小型化方面的進一步發展則能使多色雙光子激發熒光顯微成像、雙光子光纖內窺成像、三光子成像的系統結構更加緊湊合理； MEMS 技術的發展能使雙光子光纖內窺成像系統尺寸更加緊湊； 更高信號探測效率的探測器的發展能提高雙光子FLIM 對樣品的熒光采集效率， 數據采集處理技術的進步則能大大減少雙光子FLIM 的圖像處理時間； 熒光探針技術的發展可以為多色雙光子激發熒光顯微成像及三光子熒光顯微成像技術提供更多的標記選擇， 開發量子效率更高的熒光探針也有助于提高多光子成像的深度. 此外， 不同種類的多光子成像技術的結合也能相互促進， 從而大大拓寬其應用范圍， 可以預見， 隨著科研人員的不懈努力，未來激光、光纖、探測器、熒光探針等技術必將取得長足的發展， 由此促進多光子成像技術在生物醫學應用上取得更多新進展.