基于Taqman微流控芯片技術高通量檢測17種轉基因玉米品系

徐君怡 曹際娟 鄭秋月 楊莉莉 王永 鄒明強

摘?要?將Taqman微流控芯片技術應用于實時熒光PCR平臺的轉基因玉米17種品系高通量檢測。在一次PCR擴增過程中，以2個玉米內源基因 （hmgA基因、adh1基因）和1個上樣控制基因 （18S基因） 為內參照，可同時完成17種轉基因玉米品系（TC1507、NK603、MON87640、MON863、MON810、MIR162、GA21、DAS40278、BT176、BT11、98140、59122、3272、MON89034、MIR604、MON88017、T25）的單孔單重擴增的并行檢測，檢出限可達10～20 copies。本方法特異性強，靈敏度高，與“金標準”單一的實時熒光PCR方法檢測結果完全吻合，具有可多樣品、多靶標平行檢測的優勢，為轉基因產品多品系混雜鑒定檢測提供了高效、快速的方法。采用本方法，從16批進境的實用玉米中檢出9批轉基因玉米樣品，且發現其中不同程度的混雜含有1～8種品系。本方法可用于口岸進境實用農產品中多品系混雜轉基因的高通量檢測。

關鍵詞?Taqman微流控芯片; 轉基因玉米; 品系鑒定; 多品系平行檢測

1?引 言

玉米是世界上重要的糧食作物之一，其單位面積產量位居榜首[1]。近二十多年來，轉基因植物培育取得突破，推出了一批新品種[2～5]。截至2018年底，總計70個國家/地區批準了可用于食物和飼料及釋放至環境中的轉基因作物進口，其中，玉米仍然是轉化體獲批數量最多的作物[6]。

轉基因作物及其產品中轉基因成分的檢測主要有蛋白質檢測方法和核酸檢測方法。核酸檢測的目標通常為插入的外源DNA片段（即鑒定是否為轉基因）或外源插入DNA同植物基因組之間的連接區序列（即轉基因品系鑒定）;蛋白檢測目標通常為外源目標基因表達的新蛋白。這兩種檢測方法因其較高的特異性和靈敏度，被用作轉基因產品檢測的常用方法[7]。但是，基于蛋白檢測的方法有局限性，如目的蛋白穩定性不及核酸，在一些加工處理的產品中，蛋白通常已變性，很難檢測到可能有的轉基因成分;此外，蛋白抗體的制備成本較高，制備過程復雜，不適用于目前全球貿易市場上出現的越來越多的轉基因作物品系及復合品系的篩查和檢測。

聚合酶鏈反應 （PCR） 是目前轉基因生物核酸檢測的主要方法，實時熒光定量PCR （qPCR） 已成為轉基因定性和定量檢測的“金標準” [8，9]。轉基因作物及其產品中轉基因成分的檢測、鑒定和定量分析需采用復雜的多步驟程序。首先，初篩階段檢測樣品是否含有任何轉基因成分，即通過篩查檢測植物轉化體中廣泛使用的調控元件，如CaMV35S啟動子、NOS終止子等[10];其次，當篩查檢測到存在轉基因成分時，必須確定轉基因生物的品系，以便核查其生物安全證書狀態。此步驟使用的檢測方法是針對轉基因品系進行特異性鑒定，即外源插入基因同植物基因組之間的連接區序列。對于未經批準的轉基因生物品系，則需按照相關規定進行處理。不同國家對于轉基因產品的檢測閾值有不同的規定，但我國并沒有規定閾值限量，唯檢出或未檢出，未經批準商業化種植或未經審批進境的轉基因品系存在極大的生物安全性風險隱患，因此，開展轉基因品系鑒定具有極其重要的現實意義。隨著食品和飼料產品中轉基因轉化事件數量的不斷增加，在一個PCR反應中檢測多個轉基因轉化事件將加快檢測速度并提高檢測效率[11～13]。然而，由于引物間的相互干擾和某些靶點的優先擴增，使得多重PCR的擴增條件的優化難度較大。實際上，多重qPCR并未被轉基因檢測實驗室廣泛應用于常規檢測中。對于進境玉米、大豆等實用農產品業務量大的海關口岸檢測機構， 實用農產品中多種轉基因品系混雜的品系鑒定檢測是最普遍、最繁瑣的工作，因此，需要研發一種簡單快捷、靈敏準確的高通量品系鑒定檢測方法。

微流控芯片是由Manz等[14]在20世紀90年代首次提出并發展起來的跨學科分析技術。通過微加工技術，將常規實驗室的多個操作平臺集成在一張芯片完成，具有高度集成、樣品和試劑消耗量少、反應速度快、可大量平行處理的優點，在生物、化學和醫學等領域表現出巨大的發展潛力[15～19]。目前，微流控芯片技術已被廣泛用于細菌定量檢測[20]、基因擴增與分析[21～23]和蛋白質檢測[24]等領域。Kodani等[25]應用微流控芯片在278個臨床樣品中同時檢測21種呼吸道病原體;Liu等[26]利用微流控芯片同時檢測19個腸道病原靶標;Rachwal等[27]利用微流控芯片同時檢測23種病原細菌;周杰等[21]利用微流控恒溫擴增碟式芯片在65℃恒溫條件下對轉基因樣品中的P-CaMV35S、T-NOS等10種篩選靶標基因進行同步檢測，檢出限可達到0.5% （m/m）， 實現一次上樣即可完成樣品的轉基因成分篩查。

Taqman微流控芯片是一種384孔板結構的qPCR反應板，芯片中包埋Taqman探針，可進行qPCR反應。本研究將Taqman微流控芯片技術應用于轉基因玉米品系鑒定的實時熒光PCR平臺進行高通量檢測。在一次PCR擴增過程中，2個玉米內源基因 （hmgA基因、adh1基因）、1個上樣控制基因 （18S基因） 為內參照，可同時鑒定17種轉基因玉米品系（TC1507、NK603、MON87640、MON863、MON810、MIR162、GA21、DAS40278、BT176、BT11、98140、59122、3272、MON89034、MIR604、MON88017、T25），實現了多品系平行檢測、擴增檢測試劑體系的全封閉和微量化，減少了檢測成本，可為實用轉基因玉米混雜品系的快速鑒定檢測提供技術支持。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

ND-1000超微量分光光度計（美國Nanodrop公司）; 5910R高速冷凍離心機 （德國Eppendorf公司）; SORVALL ST40 高速離心機 （美國Thermo Scientific公司）;BLENDER 8011S型粉碎機 （美國Waring公司）。

玉米基因組DNA大小為2292 Mb（106 堿基數），大豆的基因組大小為1115 Mb，油菜基因組大小為1100 Mb，馬鈴薯基因組大小為1597 Mb[29]。將提取的各標準品基因組DNA溶液測定濃度后，將濃度換算成DNA拷貝數，并用10 ng/μL非目標DNA （λ DNA） 進行10倍梯度稀釋，共稀釋5個梯度，梯度稀釋后的濃度分別為100、10、5、2.5和0.5 copies/μL。取濃度為100 copies/μL的基因組DNA模板，按照2.4節的條件進行特異性實驗。

2.6?Taqman微流控芯片的靈敏度測定

取2.5節稀釋獲得的10～0.5 copies/μL濃度梯度模板DNA進行靈敏度實驗。用于靈敏度實驗的各濃度梯度樣品基因組DNA為2 μL，即每個Taqman微流控芯片反應中各轉基因品系的拷貝數分別為20、10、5和1 copy/reaction。按照2.4節的條件進行靈敏度實驗。每個濃度進行10次重復實驗。定義檢出限 （Limit of detection， LOD） 為未觀察到陰性結果的最低稀釋度水平 （即95%重復呈現陽性反應的水平）。

2.7?Taqman微流控芯片的重復性評價

用于重復性實驗的各轉基因玉米品系模板DNA濃度為100 copies/μL，取各樣品基因組DNA 2 μL，即：200 copies/reaction，按照2.4節的條件進行重復性實驗。使用5塊Taqman微流控芯片反應板進行重復性測試，每個濃度進行10次重復實驗，計算相對標準偏差 （RSD），分析測試結果的精密度。各芯片反應板間差異用p值進行統計學分析。

2.8?實際樣品的檢測

以本實驗室留存的從大連口岸進境實用玉米貨物中抽取的16批玉米樣品為待檢對象，按照試劑盒的使用方法提取基因組核酸后，進行Taqman微流控芯片和常規單一的qPCR檢測。

3?結果與討論

3.1?引物和探針設計

本研究所用引物和探針序列在SN/T 1196-2018[30]中轉基因玉米品系鑒定引物和探針序列基礎上，進行多品系通用并行擴增條件分析，重新調整設計引物和探針序列，詳見電子版文后支持信息表S1。在應用Taqman微流控芯片技術進行qPCR擴增檢測時，不能將用于單一qPCR反應的引物和探針直接結合到Taqman微流控芯片反應板上，而應調整引物的長度、G+C量值等以適應在卡板上的通用并行檢測條件。本研究結合Taqman微流控芯片的實際擴增條件，重新設計了轉基因玉米17種品系鑒定的引物和探針序列。此外，在SN/T 1196-2018[30]中，轉基因玉米品系鑒定用探針通常為TAMRA淬滅熒光標記的Taqman探針，適合于單一的qPCR反應。MGB標記的探針比TAMRA標記的Taqman探針更短，通常為10～15 bp;MGB探針具有特異性更高的優勢，可區分一個模板堿基的差異，模板只有一個堿基的差別探針不能與之雜交，可以更好地防止假陽性結果;此外，淬滅基團MGB本身不產生熒光，所有熒光背景低，靈敏度就高，可避免假陰性結果;相反，TAMRA本身會產生熒光，背景相對高，靈敏度略差，因而MGB探針更適合于微量化檢測的微流控芯片。本研究除MON88017品系、T25品系和adh1內參照檢測探針設計為常用的TAMRA熒光標記Taqman探針外，其余探針均設計為MGB淬滅熒光探針。

3.2?特異性評價

Taqman微流控芯片用于快速鑒定檢測轉基因玉米17種品系，是基于空間上的qPCR反應平臺，結果也應符合qPCR方法的判定標準[30]。測試樣品外源基因檢測Ct≥40，內源基因檢測Ct≤28，則可判定該樣品不含所檢品系;測試樣品外源基因檢測Ct≤36，內源基因檢測Ct≤28，則可判定該樣品含有所檢品系;測試樣品外源基因檢測Ct=36～40，應調整模板濃度，重做檢測。再次擴增后外源基因檢測Ct=36～40，則可判定該樣品含有所檢品系。再次擴增后外源基因檢測Ct≥40，則可判定該樣品不含所檢品系。

用建立的Taqman微流控芯片的方法分別對17種轉基因玉米品系的基因組DNA進行交叉反應擴增檢測，僅對相對應的品系產生熒光擴增曲線，內參照基因和空白對照均正常;其它品系及物種標準品均未出現擴增，曲線經歸一化處理后，對應的擴增曲線處于基線水平。此結果表明，Taqman微流控芯片各個反應孔之間相互獨立，無交叉污染，本方法可特異性地并行鑒定檢測17種轉基因玉米品系。此外，在檢測過程中發現，轉基因玉米品系MON810 （Ct=29.12） 和T25 （Ct=36.27） 偶爾會有輕微的交叉反應，MON87460 （Ct=28.35） 和59122 （Ct=36.81） 也會有偶爾輕微的交叉反應。與MON810的擴增Ct值比較， T25的Ct值延后7個循環;與MON87460的擴增Ct值比較，59122的Ct值延后8個循環。如果將陽性結果Ct值限定在36個循環，則這兩個交叉反應是可以忽略的。此結果也可能是由于玉米基因組相對較大，基因繁雜干擾、MGB探針高靈敏性能等原因所致。

3.3?靈敏度測定

為了確定Taqman微流控芯片的實時熒光PCR方法的靈敏度，將待測物模板梯度稀釋進行反應，結果表明，本方法最低可將10～20 copies/reaction的靶標分子擴增至可檢測程度;隨著濃度降低，擴增曲線起峰時間逐漸延長;當模板濃度太低時，單個拷貝數在此條件下無法完成擴增反應，因而并未出現擴增曲線，具體靈敏度測定結果見表1。由表1可知，在10次重復實驗過程中，17種轉基因玉米品系的LOD 均可達到20 copies/reaction，其中7種品系LOD 可達到10 copies/reaction。此靈敏度結果符合歐盟轉基因食品和飼料參考實驗室聯合研究中心 （Joint research centre of European Union reference laboratory for GM food and feed， EURL GMFF） 指導文件[31]所定義的轉基因產品檢測方法最低性能要求，即LOD < 25 copies/reaction。

3.4?重復性分析結果

方法的重復性 （即穩定性，RSD） 是影響Taqman微流體芯片檢測結果的重要指標。在轉基因品系濃度為200 copies/reaction的條件下，本研究中轉基因玉米17個品系鑒定基因和3個內參照在2個平行樣本之間的RSD值在0.01%～1.82%范圍內，符合EURL GMFF指導文件[31]的要求（RSD≤25%）。重復性實驗中， 5個微流體芯片反應板間的差異采用p值進行統計分析。轉基因玉米17個品系鑒定基因和3個內參照在5個反應板間的p值均大于0.05，表明本研究建立的Taqman微流控芯片方法差異性不顯著，重復性較好，方法穩定。重復性分析結果見電子版文后支持信息表S2。

3.5?進境實用玉米的品系檢測

為了驗證Taqman微流控芯片方法的準確性，采用本研究建立的檢測體系，對進境的16批次實用玉米樣品進行檢測，同時以采用“金標準”單一的qPCR方法的結果進行對照，結果如圖2所示。16批次實用玉米樣品中，9批次樣品檢出含有轉基因玉米成分，其中8批次樣品混雜有多種轉基因玉米品系。由圖2可見，#1玉米樣品僅含有1個外源重組品系T25;#5玉米樣品含有2個外源重組品系MIR604、MON88017;#11玉米樣品含有3個外源重組品系Bt11、GA21、MIR604;#10玉米樣品含有6個外源重組品系Bt11、NK603、MIR604、MON88017、MON89034、MON810;#12玉米樣品含有6個外源重組品系NK603、TC1507、59122、MON88017、MON89034、MON810;#14玉米樣品含有7個外源重組品系Bt11、NK603、TC1507、59122、MIR604、MON88017、MON810;#3玉米樣品含有8個外源重組品系Bt11、NK603、TC1507、59122、MIR604、MON88017、MON89034、MON810;#4玉米樣品含有8個外源重組品系Bt11、NK603、TC1507、59122、MIR604、MON88017、MON89034、MON810;#13玉米樣品含有8個外源重組品系Bt11、NK603、TC1507、59122、MIR604、MON88017、MON89034、MON810。Taqman微流控芯片方法的部分檢測結果見圖3。結果表明，Taqman微流控芯片方法的檢測結果與實時熒光PCR方法結果完全一致，因此，建立的Taqman微流控芯片方法特異性良好，能夠滿足對口岸進境實用玉米中轉基因玉米品系的高效并行快速檢測需求。Taqman微流控芯片方法與單一的qPCR方法相比，操作簡單，僅需加入一次DNA模板的預混液即可完成多靶標的檢測，極大地提高了檢測效率，降低了檢測試劑用量;與多重PCR擴增相比，單孔單重擴增，可避免樣品間相互干擾，具有更高的檢測靈敏度。Taqman微流控芯片的不足之處是芯片制造成本較高，單孔的檢測成本約是普通實時熒光PCR的8倍。

在ISAAA已獲批準的238個轉基因玉米品系名錄中[6]，有192個是多種重組性狀雜交的復合品系。目前，很多復合品系轉基因作物尚未獲得我國生物安全性審批許可。本研究在一份樣品進境實用玉米樣品中同時檢出1～8種外源重組品系，這可能是多個單一品系混雜，也有可能是幾個復合品系混雜造成的。如#11玉米樣品可能是Bt11 × MIR604 × GA21復合品系，而# 3玉米樣品則可能是Bt11 × 59122 × MIR604 × TC1507、MON89034 × NK603、MON89034 × 59122、MON89034 × 59122 × MON88017、MON810 × MON88017、MON810 × NK603 × MIR604等多種復合品系的混雜，存在生物安全性風險。目前，還未見轉基因作物復合品系的鑒定方法，因而，未來可以利用Taqman微流控芯片技術的多靶標同時并行檢測的特點，進一步研究建立轉基因作物復合品系鑒定方法。

4?結 論

采用Taqman微流控芯片技術進行轉基因玉米17種品系的高通量鑒定。基于qPCR平臺集成建立的Taqman微流控芯片檢測方法，可在一次PCR擴增過程中，同時完成17種轉基因玉米外源重組品系的鑒定檢測，特異性強，靈敏度高，與qPCR檢測結果完全吻合，為轉基因產品多品系混雜鑒定檢測提供了高效快速、單孔單重擴增、多樣品多靶標平行通量檢測的新方法。未來可設計出適應于轉基因大豆、轉基因油菜等品系鑒定引物和探針，將其修飾固定于Taqman微流控芯片反應板中，可用于口岸進境實用農產品中多品系混雜轉基因的高通量檢測。

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