茶樹精油對變異鏈球菌抑菌濃度及效力的探究

宋玉夢 周紅艷 黃鑫 梅予鋒

變異鏈球菌是公認的致齲菌，可通過黏附、產酸和耐酸作用破壞牙體組織而形成齲壞。目前國內外主要通過應用氟化物和氯己定等化學合成藥物抑制變異鏈球菌的生長以達到防治齲病的目的，但因存在穩定性、耐藥性、毒副作用等問題，致使尋找安全有效的抗菌藥物成為齲病預防的當務之急，目前已有一些植物提取物作為抗菌藥抑制致齲菌的生長[1-2]。近年來，有研究證實茶樹精油(tea tree oil,TTO)可以有效抑制牙菌斑的形成，起到齲病預防的作用[3]。但有效抑菌濃度、殺菌時間，抑菌效果及穩定性等均未見報道。本研究擬初步探究TTO對變異鏈球菌的最小抑菌濃度、最小殺菌濃度，評價不同濃度TTO對變異鏈球菌抑菌率，探索TTO殺菌時間和殺菌效果維持時間，為TTO的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

變異鏈球菌ATCC-25175由南京醫科大學口腔研究所提供；茶樹精油(TTO,純度為98%，南京康滿林化工實業有限公司)；牛心腦浸液培養基(BHI，Difco，美國)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma，美國)；洗必泰(福建維真園醫藥科技有限公司)；厭氧培養箱(Bugbox M，英國)；超凈工作臺(SG403，貝克公司,美國)；光吸收型酶標儀(Spectramax190，MD,美國)。

1.2 研究方法

1.2.1 細菌復蘇和培養 取-80 ℃凍存的變異鏈球菌ATCC25175標準菌株，室溫下解凍后接種于BHI 瓊脂培養基，37 ℃恒溫厭氧箱(80%N2，10%CO2，10%H2)內復蘇24 h，挑取單克隆菌株繼續培養24 h后制備菌懸液，用PBS將細菌濃度調整為1×106CFU/ml，4 ℃備用。

取凍存菌液20 ml置于錐形瓶內，37 ℃厭氧培養，每隔0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24 h 取1 ml液體，離心后PBS重懸，取200 μl置于96 孔板內，用微孔板分光光度計測吸光度值(A=600)。繪制細菌生長曲線。

1.2.2 TTO對游離變異鏈球菌生長的影響

1.2.2.1 TTO對變異鏈球菌抑菌環的影響 采用改良的牛津杯法[4]檢測TTO對變異鏈球菌抑菌環大小。取對數生長期菌液，濃度調整為1×106cfu/ml[5]，取100 μl涂平板，在同一培養皿內放置5 個自制牛津杯，各孔分別加入100 μl TTO，濃度為20%、10%、5%，另設2 個對照組，分別加入100 μl 0.2%氯己定(CHX)，100 μl滅菌0.5%Tween-80。4 ℃靜置2 h，37 ℃厭氧培養24 h觀察結果。實驗重復3 次。

1.2.2.2 TTO對變異鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC) 根據CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)標準化指導方法[6]，采用標準微量肉湯稀釋法進行MIC的測定。96 孔板內第1至9列每孔中加入菌懸液100 μl， BHI培養液100 μl。第一孔內加入TTO終濃度為2%，依次進行二倍稀釋至終濃度0.031 25%，陽性對照組含0.2%CHX，陰性對照組不加任何藥物，空白對照組加200 μl滅菌BHI培養液。37 ℃厭氧培養24 h。24 h后肉眼觀察，尚澄清孔所對應的最低藥物濃度為MIC。選取大于MIC濃度各組，每組隨機選一孔，取10 μl按1∶10 000稀釋，100 μl轉移至培養皿中，37 ℃厭氧培養48 h，菌落計數，在平板上未觀察到菌落生長的濃度為MBC[7]。每個實驗組均設5 個平行組，實驗重復3 次。

1.2.2.3 TTO在對變異鏈球菌的抑菌率 將配置好的菌液分為7 組，用BHI將菌液濃度調整為為1×106cfu/ml，加入TTO終濃度分別為2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.0625%、0.03125%，陽性對照組加入0.2%CHX，陰性對照組不加任何藥液。37 ℃厭氧培養12、24、48 h后分別取樣，離心，PBS洗菌3 次，1 ml PBS重懸，加入96 孔板，MTT染色，避光培養4 h，離心，棄上清，加DMSO，溶解15 min后測吸光度，A=570，計算抑菌率。

抑菌率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%

1.2.2.4 TTO對變異鏈球菌殺菌時間 將制備好的菌液分別置于5 個錐形瓶內，加入TTO，終濃度為4MBC、2MBC、MBC、MIC、1/2 MIC，陽性對照組加0.2% CHX，陰性對照組不加任何藥物。0、15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h后取樣，離心，棄上清。PBS洗菌3 次后重懸，4 ℃暫存，取樣結束后將所取樣本加入96 孔板內，MTT進行染色，方法同上。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 變異鏈球菌生長曲線測定

變異鏈球菌生長曲線如圖 1，根據實驗結果可知，變異鏈球菌生長周期為24 h，生長8～12 h時處于對數增長期。

圖 1 變異鏈球菌生長曲線

2.2 TTO對游離變異鏈球菌生長的影響

2.2.1 TTO對變異鏈球菌抑菌環的影響 實驗結果如表 1，5%TTO組，10%TTO組與陽性對照組比較，差異有統計學意義(t5%=14.190，P5%=0.000；t10%=8.093,P10%=0.000)。20%TTO組與陽性對照組比較差異無統計學意義(t=1.497,P=0.815)。

表 1 TTO 對變異鏈球菌抑菌環大小

2.2.2 TTO對變異鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC) TTO濃度為0.125%時，自然光下肉眼見96孔板澄清無渾濁，MIC為0.125%，將澄清孔按1∶10 000比例稀釋后涂板，0.25%TTO未見菌落生長，MBC為0.25%。

2.2.3 TTO對變異鏈球菌的抑菌率 24 h內，0.25%及以上濃度TTO均能完全殺滅細菌，抑菌率為100%。0.125%TTO抑菌率為90.97%±0.77%，69.94%±4.46%與對照組相比，差異無統計學意義(t12=7.390,P12=0.947；t24=4,627,P24=0.219)。0.06%TTO抑菌率為34.75%±9.96%,47.31%±5.60%，與對照組差與有統計學意義(t12=8.926,P12<0.01；t24=10.601,P24=0.045)。0.03%TTO抑菌率為33.21%±1.36%，35.17%±5.80%，與對照組相比差異有統計學意義(t12=58.196,P12<0.01；t24=13.828,P24=0.026)。

圖 2 不同濃度TTO在不同時間下對變異鏈球菌抑菌率

48 h時，0.5%TTO可完全殺滅細菌，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)。濃度小于0.5%時，抑菌率分別為：68.63%±0.47%、61.72%±1.76%、46.72%±11.56%，與對照組相比差異無統計學意義(t0.25=1.715,P0.25=0.068；t0.125=7.30,P0.125=0.416；t0.06=1.01,P0.06=0.133)。0.03%TTO抑菌為43.15%±3.66%，與對照組相比差異有統計學意義(t0.03=1.819，P0.03=0.046)(圖 2)。

2.2.4 TTO對變異鏈球菌的殺菌時間 當TTO濃度大于等于0.25%時，均可在1 h內完全殺滅細菌，0.125%TTO可在1 h內抑制細菌生長，此后12 h內各組均未見明顯的細菌增殖現象。0.06%TTO在4 h內達到抑菌效果，此后見細菌增殖現象(圖 3)。

圖 3 不同濃度TTO殺滅變異鏈球菌的工作時間

3 討 論

齲病作為一種危害人類口腔健康最常見的疾病，對口腔健康造成較大威脅。變異鏈球菌作為主要的致齲菌能在牙齒表面形成牙菌斑生物膜導致齲病的發生[8]。目前，控制變異鏈球菌生長的藥物主要為化學性藥物，其中氟化物和氯己定的應用最為廣泛。氟化物可以抑制變異鏈球菌生長，然而研究發現短暫的氟化物處理并不能維持對生物膜中變形鏈球菌的抗酸活性，損傷可以隨時間恢復[9]。此外，氟化物的廣泛應用易引起耐氟菌株產生[10]，并且氟濃度穩定性較差，過多或不當使用可導致人體慢性氟中毒,產生氟斑牙、氟骨癥[11-12]。氯己定作為一種廣譜抗菌藥物被廣泛應用于口腔細菌的控制，但長期使用廣譜抗菌劑易引起口腔菌群失調、使細菌產生耐藥性、著色等問題。此學者們將目光轉移到安全性更高的植物性抗菌藥。

TTO是從互葉白千層植物新鮮枝葉中提取得到的淡黃色液體，主要成分是單萜烯、醇類及倍半萜類化合物，約占總量的70%以上，其中4-萜烯醇和1,8-桉樹腦是茶樹精油抗菌活性的物質基礎[13]，主要通過破壞膜結構，抑制微生物呼吸途徑中線粒體酶、脫氫酶活性，影響細胞呼吸作用，干擾胞內大分子物質活性等形式達到殺菌作用[14]。近年來，有研究證實TTO能控制菌斑生長，抑制變異鏈球菌活性[15-16]，但現存的實驗對TTO抑制變異鏈球菌的抑菌濃度、殺菌時間及作用效果等均未做出明確解釋，使得無法將TTO投入到臨床使用。本實驗探究了TTO對變異鏈球菌的抑菌效果，最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，研究不同濃度TTO對變異鏈球菌的抑菌率，并探究TTO的殺菌時間，為TTO精油的臨床應用提供理論依據。

本實驗利用瓊脂盤擴散實驗證明隨著濃度的增加，TTO對變異鏈菌抑菌環直徑呈劑量依賴性增大。20%TTO抑菌環直徑為(20.26±3.64) mm,與陽性對照組(22.11±1.85) mm作用效果相當。根據文獻可知，植物精油的抗菌活性可分為三級：抑制區≤12 mm，活性弱；12 mm<抑制區<20 mm，活性中等；抑制區≥20 mm，活性強[17]。因此20%TTO對變異鏈球菌抗菌活性較強。然而TTO溶解性差，揮發性較高[13],且在瓊脂培養基中擴散性受到時間，溫度等影響，抑菌效果會被低估，因此選擇后續實驗對其抑菌效果加以佐證。

標準肉湯稀釋法得出TTO對變異鏈球菌的MIC為0.125%，MBC為0.25%，與Chandrdas等[18]的研究結果基本一致。抑菌率實驗可知，當TTO濃度大于等于MBC時，抑菌率為100%，與0.2%CHX效果相當，當TTO濃度小于MBC時，抑菌率呈現濃度依賴性趨勢，隨著濃度的降低，TTO抑菌率逐漸降低。此外，TTO抑菌率也受時間的影響，高濃度下(>0.25%)48 h內均可達到完全殺菌效果，0.25%TTO在48 h時已無法達到完全殺菌作用，0.125%TTO抑菌率也出現明顯降低，較低濃度(0.06%、 0.03%)抑菌效果隨時間變化不明顯。陽性對照組0.2%CHX在48h時殺菌效果明顯降低，無法起到殺菌作用。由此可知當0.5%TTO時殺菌效果較好，殺菌效果維持時間較長，可作為臨床使用的參考濃度。

通過殺菌時間實驗評估抗菌活性，驗證細菌殺滅和再生長的速率，殺菌范圍和時間，此方法是體外研究殺菌研究最常用的模型之一[19]。實驗證實TTO作用所需時間與藥物濃度沒有明顯相關性，各濃度在藥物作用1 h后效果均達到最佳。與氯己定相比所需時間較長。猜想TTO作為植物性抑菌藥物，作用效果溫和，作用時間略長，但作用效果更穩定。此外，0.2%CHC殺菌過程中產生大量黃褐色沉淀黏附在管壁上難以清除，但實驗組并未出現此情況，因此推測TTO能有效避免牙齒著色的問題。

綜上所示，TTO作為一種殺菌劑，能有效抑制變異鏈球菌活性，起到殺滅變異鏈球菌的作用，殺菌所需濃度較低，作用溫和，效果穩定。但TTO對變異鏈球菌結構和形態的影響，以及其生物安全性并未明確，是后續實驗的研究方向。