STAT3介導甲狀旁腺激素調控張應力下牙槽骨塑建

張程 呂春曉 李天成 陶貴渝 黃鸝 鄒淑娟

牙槽骨在正畸力作用下發生骨塑建，張力側表現為成骨，壓力側表現為破骨。有效的成骨塑建有助于維持正畸治療結果的穩定，避免治療過程中牙齒的過度松動、牙槽骨吸收，是有效、穩定、安全的正畸治療的生物學基礎。加強張應力區的成骨活動，對獲得理想的正畸治療結果、減少牙周并發癥具有積極意義，尤其是成骨活動有所減弱的成年患者。

人甲狀旁腺激素(PTH)(1-34)(商品名特立帕肽)是一種通過增強成骨活動治療婦女絕經后骨質疏松的藥物[1]，小劑量間歇性給藥通過增強成骨活動增加骨量，大劑量給藥增強破骨活動，使骨量減少[2]。有研究表明，PTH對重癥慢性牙周炎的治療有較好的效果[3]；在正畸治療方面，可以通過上調破骨細胞活性加速正畸牙移動[4-5]，有助于保持正畸治療結果的穩定[6]，促進正畸力引起的牙根吸收的牙骨質修復[7]。以上研究結果表明PTH可能參與了調控正畸牙槽骨塑建過程，但現有文獻缺乏此方面研究。深入研究PTH對正畸力作用下牙槽骨塑建的調控機制是臨床上精準應用PTH促進牙槽骨成骨塑建、降低牙槽骨吸收及復發風險的基礎。

體外研究證實，PTH可以快速促進成骨細胞表達IL-6及其受體[8]。IL-6信號通路的一個重要的胞內下游分子是信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)。研究表明，STAT3的激活促進成骨前體細胞成骨向分化，骨鈣素(OCN)表達水平和堿性磷酸酶(ALP)活性提高[9]，并介導了IL-6家族細胞因子oncostatin M促進成骨的作用[10]。此外，STAT3是骨組織中力學信號轉導因子，介導了力學加載下骨組織的形成過程[9]。但STAT3是否參與PTH調節張應力引起的牙槽骨成骨塑建過程尚不清楚。本研究通過建立大鼠牙移動模型并應用小鼠成骨前體細胞系MC3T3-e1，初步探究間歇性給予PTH調節正畸牙槽骨塑建中成骨活動的機制及STAT3在此過程中的作用，為臨床上改善正畸牙槽骨塑建效果提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-MEM培養基、胎牛血清(Gibco，美國)；青霉素-鏈霉素(雙抗)溶液、胰蛋白酶(Hyclone，美國)；人甲狀旁腺激素(1-34)(Bachem，美國)；Stattic(STAT3抑制劑)(Selleck，美國)。

1.2 實驗動物及分組

8 周齡雄性Wistar大鼠24 只(達碩實驗動物有限公司)，體重220～250 g，隨機平均分為3 組：空白組，間歇性PTH給藥組，間歇性PTH給藥加Stattic組。間歇性PTH給藥組每天相同時間在背部皮下注射40 μg/kg體重的PTH，對照組注射等體積生理鹽水。間歇性PTH給藥加Stattic組在注射PTH的同時局部注射Stattic，全身麻醉大鼠后，以微量注射器在加力的第一磨牙近中腭側距齦緣2 mm處進針，于粘骨膜下注射10 μl Stattic(50 μmol/L)，每隔1 d注射1 次，相鄰2 次注射間隔48 h；對照組注射等體積生理鹽水。從建立牙移動當天起開始注射PTH，提前2 d開始注射Stattic。在牙移動的第14天以過量麻醉法處死大鼠，收集雙側上頜骨，4%多聚甲醛4 ℃固定48 h。

1.3 大鼠牙移動模型建立

大鼠經乙醚吸入麻醉后，將鎳鈦拉簧結扎于雙側上頜第一磨牙與同側切牙之間，拉簧力值為40 g。

1.4 免疫組織化學染色及定量分析

標本經10%EDTA溶液脫鈣8 周后脫水、石蠟包埋、切片。切片經常規免疫組化染色后，以Image J定量分析第一磨牙遠中頰根近牙頸部三分之一張力側牙周膜區域STAT3平均光密度及單位面積內成骨相關轉錄因子(osterix,OSX)陽性細胞數。每組隨機分析3 張切片，取平均值。

1.5 細胞培養

小鼠成骨前體細胞MC3T3-e1(亞克隆14)，于含10%胎牛血清、1%雙抗的α-MEM培養基中擴增；在上述培養基中加入抗壞血酸(終濃度50 μg/ml)、β-甘油磷酸鈉(終濃度10 mmol/L)即為成骨誘導液，用于藥物刺激實驗。

1.6 間歇性PTH給藥細胞模型的建立

實驗分為空白組，間歇性PTH給藥組，間歇性PTH給藥加STAT3抑制劑Stattic組。PTH組細胞在含100 ng/ml PTH的成骨誘導液中孵育6 h后，換成不含PTH的成骨誘導液繼續孵育18 h，每24 h為1循環，連續3 個循環完成間歇性PTH給藥。PTH加抑制劑組細胞在含100 ng/ml PTH和5μmol/L Stattic的成骨誘導液中孵育6 h后，換成僅含5 μmol/L Stattic的成骨誘導液繼續孵育18 h，每24 h為1循環，連續進行3 個循環完成間歇性PTH與Stattic的聯合給藥。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)

用高純總RNA提取試劑盒(北京百泰克)按說明書提取細胞總RNA，測定RNA濃度和純度后，用cDNA逆轉錄試劑盒(Thermo Scientific，美國)合成cDNA，TB Green?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)(Takara，日本)進行RT-qPCR檢測，檢測基因名稱及正反引物序列見表 1，以Gapdh為內參。

表 1 RT-qPCR引物序列

1.8 蛋白質免疫印跡(WB)

用總蛋白提取試劑盒(Signalway Antibody，美國)提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液于99 ℃變性。樣本于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉印至PVDF膜，膜經封閉、抗體雜交后顯影。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 間歇性PTH給藥在動物模型及細胞模型中對STAT3通路激活情況的影響

WB結果提示，PTH組MC3T3-e1細胞中STAT3總蛋白及磷酸化蛋白(Tyr705)表達量與對照組相比明顯增加(圖 1)。免疫組化結果顯示，PTH組大鼠在牙移動第14天時，張力區牙槽骨表面成骨細胞內及牙周膜內STAT3表達量與對照組相比明顯增加；局部注射Stattic后，STAT3表達量降低(圖 2)。

2.2 間歇性PTH全身給藥及局部注射STAT3抑制劑Stattic對大鼠正畸牙移動中成骨活動的影響

免疫組化結果顯示，PTH組大鼠在牙移動第14天張力區牙槽骨表面OSX陽性成骨細胞數量與對照組相比明顯增加，全身PTH給藥結合局部注射Stattic組OSX陽性細胞數目較PTH組明顯減少(圖 3)。

2.3 間歇性PTH給藥及STAT3抑制劑Stattic對MC3T3-e1成骨向分化的影響

RT-qPCR結果顯示，經過3 個循環的間歇性PTH給藥，MC3T3-e1的成骨分化標志基因Col1a1、Osx、Alp、Runx2表達增加；PTH與Stattic共同給藥組中，PTH對上述基因的上調作用被削弱，各基因組間表達水平均存在統計學差異(圖 4)。

圖 1 STAT3和p-STAT3表達在各組MC3T3-e1細胞中的表達

圖 2 大鼠牙移動張力側牙槽骨表面成骨細胞及牙周膜內STAT3表達(免疫組化， ×100)

圖 3 大鼠牙移動張力側牙槽骨表面OSX陽性細胞數量(免疫組化， ×100)

3 討 論

近年來，尋求正畸治療的成人患者逐年增加，成人患者行正畸治療比青少年及兒童存在更高的風險，包括：牙齦萎縮、牙齒松動、牙根吸收、治療結束后容易復發等。成人患者成骨能力下降，成骨前體細胞儲備不足，骨質逐漸流失，是形成上述并發癥的主要原因之一[11]。因此，為了給成人患者提供安全有效的正畸治療，增強牙槽骨塑建過程的成骨活動是一個可能有效的手段。本研究發現，間歇性全身給予PTH可以促進大鼠正畸牙槽骨塑建中張力側牙槽骨表面細胞的成骨向分化，提高成骨細胞特異性轉錄因子OSX的表達，該分子為間充質干細胞向成骨細胞分化的關鍵轉錄因子，參與啟動骨基質分泌及礦化相關的諸多基因的轉錄[12]；與此同時，間歇性PTH給藥也增加該區域成骨細胞內STAT3表達，局部注射STAT3抑制劑Stattic則削弱PTH增加成骨活動的效應及STAT3蛋白的表達，說明STAT3參與了PTH促進成骨塑建的過程。間歇性PTH給藥可以上調小鼠成骨前體細胞系MC3T3-e1的STAT3總蛋白和磷酸化蛋白(Tyr705)水平，促進成骨分化相關基因表達，這種作用依賴于STAT3的磷酸化，可以被STAT3抑制劑Stattic削弱。本研究從體內和體外兩方面說明，間歇性PTH給藥可以促進正畸牙槽骨成骨塑建，并通過激活STAT3發揮作用。

圖 4 MC3T3-e1細胞中成骨標志基因Col1a1、Osx、Alp、Runx2的表達

細胞實驗結果顯示，間歇性PTH可以同時促進STAT3總蛋白和活化態蛋白即磷酸化STAT3(Tyr705)的表達。作為IL-6家族細胞因子重要的胞內下游信號轉導蛋白，STAT3激活水平在間歇性PTH刺激后升高，與前期研究PTH促進成骨細胞IL-6釋放的結果相符合[8]。此外，有學者發現牙周膜內IL-6和STAT3在牙移動過程中被上調[13]，說明IL-6和STAT3本身可能參與牙移動的牙槽骨塑建過程，而間歇性PTH給藥的效應與這一生理反應可能產生了協同作用。

本研究為改善正畸牙槽骨塑建、降低成人正畸治療并發癥提供了新的思路。牙周膜成纖維細胞作為正畸力轉導的主要細胞，其在應力微環境下對PTH的反應值得深入研究。此外，PTH對牙槽骨塑建的破骨活動的影響也是下一步的研究方向。