TRPA1和TRPV4在牙齦瘤中的表達及意義

米會會 孫斌 陶林 沈亞峰 徐江

牙齦瘤來源于牙周膜及頜骨牙槽突的結締組織，以牙齦增生為主要表現，切除后易復發。根據病理結構牙齦瘤常分為纖維性、肉芽腫性及血管性3類[1]。牙齦增生與牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts,HGFs)、上皮細胞及細胞外基質增多有關。鈣離子阻滯劑(calcium channel bockers，CCB)作為常用降壓藥，隨著我國高血壓患病率的增高，服該類藥物的患者增多，臨床上鈣拮抗劑誘導的牙齦增生已居藥物性牙齦增生(drug-induced gingival overgrowth，DGO)首位[2]。CCB主要通過阻礙心肌和血管平滑肌鈣離子的膜轉運，抑制鈣離子流入細胞內引起心肌收縮性降低和血管擴張，從而降低血壓，而CCB如何引起牙齦增生，目前機制仍不明確。瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)通道參與許多細胞病理生理學變化，與牙齦增生有密切聯系。TRPA1(瞬時受體電位通道A1)是非選擇性能透過鈣離子的通道，激活時主要引起鈣離子內流，對氧化應激的多種產物、細菌毒素敏感[3]，與DGO硝苯地平[4]最相關。研究已證實HGFs表達TRPA1和TRPV1陽離子通道。TRPV4主要介導鈣離子內流，已有研究表明TRPV4廣泛表達于如神經、血管心臟和腎臟等組織[5]。本研究探討TRPA1和TRPV4在牙齦瘤中的表達，并分析其與腫瘤臨床病理參數的關系。

1 材料與方法

1.1 組織標本

選取石河子大學第一附屬醫院2008 年6 月～2018 年6 月手術切除的牙齦瘤存檔石蠟標本201 例。牙齦瘤均經病理確診并分型。其中纖維性108 例，肉芽腫性55 例，血管性38 例。另選取48 例來自下頜第三磨牙埋伏阻生拔出術后的牙齦組織，經HE染色后閱片確診，作為正常對照。實驗組中，男87 例，女114 例，平均(45.18±15.16) 歲；對照組中，男22 例，女26 例，平均(38.03±13.16) 歲。2 組患者性別、年齡分布均無明顯差異(P>0.05)。

服用硝苯地平的DGO組納入標準[6]：①有高血壓病史且服用硝苯地平時間大于半年；②伴有牙齦增生，上下頜前牙區嚴重；③需排除糖尿病等其他全身性疾病；④未同時服用苯妥英鈉、環孢素A等其他引起牙齦增生的藥物；⑤近半年未接受過牙周基礎治療；⑥手術前3 個月內無抗生素服用史。排除標準：①治療期間換用非鈣離子阻滯劑類降壓藥物者；②口服避孕藥者；③由非鈣詰抗類藥物(如苯妥英鈉、環胞菌素-A)引起的牙齦增生者。

1.2 主要試劑

TRPA1抗體(ab62053，1∶200)、TRPV4抗體(ab94868，1∶100)(Abcam公司，英國)；免疫組化試劑盒(封閉液、二抗、SAB復合物以及DAB顯色試劑)(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 實驗方法

采用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)法檢測。步驟：將牙齦組織標本固定包埋后切片，脫蠟后EDTA修復抗原，3%H2O2孵育。BSA處理后分別加入一抗覆蓋組織，以PBS為陰性對照4 ℃過夜后加入相應種屬的二抗，孵育漂洗后加入新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察控制顯色(陽性染色為棕黃色)。顯色完全后沖洗切片，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，氨水反藍。將干燥透明后的切片封固待觀察。

1.4 結果判定

由2 名病理科副主任醫師分別單盲法閱片。采用判定標準[7]：對每張切片的陽性細胞數比例及著色深淺進行計分，以細胞質及細胞膜內出現棕黃色至深棕黃色為陽性，根據著色的強弱程度和陽性細胞所占百分比進行評定和分析。積分數=陽性染色細胞百分比評分×染色強度評分。陽性染色細胞百分比判定標準：每個標本都隨機選擇3個高倍視野(×200)，計數陽性細胞數占細胞總數的百分比(陽性細胞百分率):<5%為0 分；6%～25%為1 分；26%～50%為2 分；51%～75%為3 分；>75%為4 分。染色強度判定標準為：無著色為0 分；淡黃色為1 分；黃色為2 分；棕黃色為3 分；棕褐色為4 分。陽等級：1～4為陰性(-)；5～8 分為弱陽性(+)；9～12 分為陽性(++)。

1.5 統計學分析

采用IBM SPSS 20.0統計學軟件進行統計分析，計數資料比較采用χ2檢驗，相關性行Spearman等級相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TRPA1和TRPV4在牙齦瘤和正常組織的表達

正常牙齦組織中，TRPA1和TRPV4的表達多為弱陽性或陰性，主要表達于上皮基底層細胞、內皮細胞和成纖維細胞的細胞膜及細胞質(圖 1)。在牙齦瘤中，TRPA1和TRPV4表達于表皮全層及間質的細胞質和細胞膜(圖 2)。TRPA1和TRPV4陽性表達率分別為56.72%(114/201)和88.56%(178/201)，正常組陽性表達率分別為35.42%(17/48)和66.67%(32/48)，牙齦瘤組明顯高于正常組(P<0.05)(表 1)。

圖 1 TPRA1和TPRV4在正常組織中的表達(×200)

2.2 TRPA1和TRPV4表達與牙齦瘤患者臨床參數之間關系

TRPA1和TRPV4表達與牙齦瘤患者臨床參數之間關系見表 2。TRPA1和TRPV4表達與牙齦瘤患者年齡呈顯著相關(P值分別為0.000、0.006)，且年齡越大，TRPA1和TRPV4表達越低。TRPA1和TRPV4表達與是否為藥物性牙齦增生顯著相關(P<0.001)，相比之下，二者均在非藥物性牙齦增生中表達較高，在藥物性牙齦增生中表達低。TRPA1和TRPV4表達與患者性別無關(P>0.05)；TRPA1表達與牙齦瘤患者病理分型無關(P>0.05)，而TRPV4表達與病理分型相關(P<0.05)，以血管性牙齦瘤陽性率最高95.35%(41/43)，其次是纖維性牙齦瘤92.59%(100/108)，肉芽腫性牙齦瘤陽性率較低74.00%(37/50)。

圖 1 TRPA1和TRPV4在牙齦瘤組織中的表達×200)

表 1 TRPA1與TRPV4在牙齦瘤和正常組織中的表達

表 2 TRPA1與TRPV4在牙齦瘤中的表達與各臨床參數之間的關系

2.3 牙齦瘤組織中TRPA1和TRPV4的相關性

牙齦瘤組織中TRPA1和TRPV4的相關性見表 3。牙齦瘤組織中TRPA1和TRPV4表達呈顯著正相關(r=0.486，P<0.001)。

表 3 牙齦瘤組織中TRPA1和TRPV4的相關性

3 討 論

TRP通道于1969 年首次在果蠅的視覺系統中被發現[8]，是非選擇性陽離子通道，廣泛分布于多種生物中。可被多種刺激激活，如機械牽張[9]、溫度變化[10]、氧化應激[11]和炎性因子等，繼而激活下游相關陽離子通路，參與細胞舒縮、增殖及分化等多種病理生理功能。不同的TRP通道對鈣離子、鎂離子、鈉離子、氫離子等離子的通透選擇性不一樣。TRPA1激活后可以增加細胞外陽離子，如鈉離子、氫離子，尤其是引起鈣離子的內流，從而在氧化反應、炎癥反應和血管擴張等過程中發揮重要作用。TRPA1主要在背根神經、三叉神經和迷走神經的初級感覺神經元中表達[12]。近年研究表明，大量非神經細胞也存在TRPA1的表達，如肺成纖維細胞、血管內皮細胞、牙髓成纖維細胞和牙本質細胞等[13-15]。López-González等[16]通過細胞實驗研究發現TRPA1、TRPV1及TRPV1b在人牙齦成纖維細胞中表達。這與本實驗中TRPA1在正常牙齦組織中表達結果一致。TRPV4廣泛表達于感覺、消化、呼吸、心血管等系統，參與多種生理及病理過程。TRPV4可被溫度、剪切力、滲透壓等理化刺激激活，可引起鈣離子、鈉離子的流動，并主要通過對鈣離子的調控及細胞內信號轉導通路，產生異構體等不同連接方式，影響細胞增殖、分化、遷移和凋亡等，進而在腫瘤的發生發展中發揮作用[17]。與正常組織細胞比，TRPV4在多數腫瘤細胞中高表達，如肝癌、胃癌、肺鱗狀細胞癌、結直腸癌等[17]；極少數情況下呈低表達，如前列腺癌和食管癌[18]。

目前，TRP通道在口腔疾病中的相關研究極少。EI等[19]發現人類齲齒大量表達成牙本質細胞。Kun等[20]研究發現小鼠結腸炎癥反應中TRPA1 mRNA高表達。相反，Tazawa等[21]在新鮮分離的天然成牙本質細胞或牙髓組織中未發現TRPA1 mRNA，他們推測可能因為研究中所選牙齒均無炎癥，以致TRPA1表達太低而無法檢測到，而齲齒的成牙本質細胞感染和炎癥改變了成牙本質細胞特性和TRPA1通道表達。本研究發現TRPA1在牙齦瘤中的表達顯著高于正常組織，考慮牙齦瘤主要是炎癥刺激等因素產生的，而正常組織中炎癥因子極少，因而TRPA1表達較低，或者不表達。本研究發現，牙齦瘤中TRPV4的表達亦顯著高于正常牙齦組織。李孝瓊等[22]，通過阻滯TRPV4，能夠抑制宮頸癌HeLa細胞(實驗用增殖表皮癌細胞)增殖，并推測TRPV4在宮頸癌HeLa細胞異常增殖中可能具有負向調控作用。Yamada等[23]研究表明，TRPV4高表達后刺激肝星狀細胞增殖，進而間接誘發肝癌。相較于TRPA1在口腔中的研究進展，TRPV4則鮮有報道。而TRPV4作為TRPVs家族中的一員，研究結果發現，TRPV4在牙齦瘤中高表達，在正常牙齦組織中也有表達，主要表達在上皮基底層細胞、內皮細胞和成纖維細胞的細胞膜及細胞質細胞中。

本研究發現TRPA1和TRPV4表達均與牙齦瘤患者性別無關，但二者均與年齡及是否為藥物性牙齦增生顯著相關。且本研究發現TRPA1和TRPV4在牙齦瘤中表達呈正相關。本研究入選的藥物性牙齦增生患者以服用鈣離子阻滯劑的高血壓患者為主，國外資料顯示鈣通道阻滯劑引起藥物性牙齦增生患病率為15%～85%，國內學者報道為20%[24]。鈣通道阻滯劑的藥理學機制是：作用于冠狀血管和周圍平滑肌細胞，且能夠選擇性阻滯細胞膜鈣通道，阻止鈣離子內流，減少細胞內可利用鈣離子[25]。作為細胞內重要的第二信使，鈣離子濃度變化引起細胞功能明顯改變，而TRPA1和TRPV4均是以鈣離子為主要透過性陽離子通道，推測鈣離子阻滯劑類藥物對兩通道均有抑制作用，從而導致TRPA1和TRPV4在在非藥物性牙齦增生中表達顯著高于藥物性牙齦增生，且差異有統計學意義，繼而為探索藥物性牙齦增生的機制提供新可能。而隨著老齡化社會的進入，高血壓患者逐漸增多，服用鈣離子阻滯劑的患者也逐漸增加，因此，當年齡越大，藥物性牙齦增生患者相對越多，則TRPA1和TRPV4表達就相對越低，恰與藥物性牙齦增生表達較低結果一致。

本研究中，TRPA1表達與牙齦瘤患者病理分型無關，而TRPV4表達與之相關，且在血管性牙齦瘤中表達最高，肉芽腫性牙齦瘤中表達最低，推測可能與TRPV4在血管內皮細胞中大量表達有關。研究表明TRPA1基因最初是從人成纖維細胞中克隆的[26]然后在一部分神經纖維[27-28]中確定，而肺成纖維細胞中僅檢測到TRPA1的表達[29]。研究表明TRPV4主要表達于血管內皮細胞和II型肺泡細胞中，少量表達于巨噬細胞、肥大細胞等炎細胞[30-31]。而肉芽腫性牙齦瘤中以大量炎細胞及部分新生血管為主，血管性牙齦瘤則以大量成熟血管為主，伴少量炎細胞。

本研究通過對TRPA1和TRPV4在牙齦瘤中的表達以及與牙齦瘤患者的臨床病理參數之間的關系的研究，發現TRPA1和TRPV4均在牙齦瘤中高表達，提示二者可能與牙齦瘤發生相關，其具體機制有待研究。