鈣衛蛋白調控口腔鱗癌細胞侵襲遷移作用機制

孫俊澤 馬洪 胡赟 鮑玲娜

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常見的頜面部惡性腫瘤，有高度的惡性、強侵襲、快轉移等特性[1]。每年約有11 000例死亡，病死率仍逐年上升，存活率低主要與腫瘤侵襲和遠處轉移關聯密切。因此,早期診斷和靶向抑制其發生進展及轉移是防止和治療的關鍵。S100A8/A9蛋白是以Ca2+依賴形式的一種鈣結合蛋白，研究表明，S100A8和S100A9在胃癌、結直腸癌及鼻咽癌等腫瘤性疾病侵襲轉移中建立預轉移性龕，加快腫瘤轉移[2]。有研究報道，抗S100A8/A9蛋白單克隆抗體可以有效抑制小鼠模型中S100A8/A9蛋白調控的黑色素瘤的轉移[3]。但S100A8/A9蛋白在腫瘤侵襲遷移中的作用和機理尚未報道。本實驗探究S100A8/A9蛋白對OSCC細胞侵襲遷移和p38MAPK信號通路的影響及機制，為OSCC靶向藥物研發及進一步實驗提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

舌鱗癌細胞SCC-25和CAL-27(ATCC,USA)；S100A8蛋白和S100A9蛋白(Abcam,USA)；胎牛血清(BI,IRS)；DMEM-F12培養基和高糖DMEM培養基(Gibco,USA)；兔抗p-p38MAPK、p38MAPK單克隆抗體、抗gapdh抗體及二抗(CST,USA)；通路抑制劑SB203580(MCE,USA)；顯影液(Millipore，USA)；CCK-8試劑盒(Biosharp)；Transwell小室、培養板和培養皿(Corning,USA)；基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease 2,MMP-2)和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease 2，MMP-9)序列設計(廣州博銳生物)；RNA提取試劑盒(Roche,德國)；逆轉錄試劑盒(TAKARA,日本)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 在含有DMEM-F12/DMEM培養基的25 cm2培養瓶內培養SCC-25和CAL-27，培養的條件為37 ℃、5%CO2，細胞增殖匯合達80%時傳代。

1.2.2 CCK-8檢測細胞增殖活性 收集對數周期的細胞，先后沖洗、消化、調整細胞密度，在96孔板培養使每孔約含103個細胞，將S100A8和S100A9重組蛋白混合并在4 ℃下孵育1 h以形成S100A8/A9蛋白復合物[4]，細胞基本貼壁后，調整S100A8/A9蛋白濃度為0、1、5、15、25、35 μg/ml的無血清培養基，24 h的時候在每孔按說明書加適量的藥劑，等1.5 h后用酶標儀測吸光度數的值。

1.2.3 劃痕實驗 收集對數周期的細胞密度大約為1×105個/ml，細胞貼壁，槍頭垂直孔板劃線，清洗劃下來的多余細胞,加入不含血清的培養基，設置S100A8/A9組及Control組，S100A8/A9組中加入1 μg/ml S100A8/A9蛋白，37 ℃、5%CO2條件下培養，于0、24、48、72 h進行拍照。

1.2.4 細胞的遷移實驗和侵襲實驗 細胞遷移實驗收集對數周期的細胞，先后清洗、消化，調整細胞密度。在Transwell小室的下室中加600 μl的培養基且每毫升含有1 μg S100A8/A9蛋白,上室1×105個/200 μl細胞，24 h后小室取出清洗，先固定后染色，清洗干燥后鏡下隨機選5 個視野統計小室聚碳酸酯膜下表面細胞數。細胞侵襲實驗檢測操作步驟按照細胞遷移實驗調整細胞密度，在小室上表面涂抹適量厚度基質膠，然后再加入1×105個/200 μl細胞，后續操作步驟同上。最后顯微鏡下觀察小室聚碳酸酯膜下表面附著的侵襲細胞數，隨機選取選5 個視野統計細胞數。

1.2.5 Western blot 蛋白質印跡法按照細胞的裂解方法提細胞總蛋白,每條泳道含有60 μg總蛋白,電泳完成后將10%SDS-PAGE膠上目的蛋白轉到膜上,室溫條件下封閉約2 h,一抗(1∶2 000)在4 ℃條件下過夜孵育,TBST洗3遍,在室溫條件下二抗(1∶8 000)孵育大約2 h;TBST洗3 遍,成像系統下進行成像。圖形分析軟件Image J對圖片進行處理,用每一個組的p-p38MAPK、p38MAPK和gapdh蛋白灰度的比分析樣品蛋白的相對表達情況。

1.2.6 細胞免疫熒光染色 收集對數周期的細胞，先后清洗、消化，調整細胞密度。根據蛋白質印跡法結果設為0 h組、1 h組、12 h組，固定細胞，封閉，加入一抗p-p38MAPK(1∶50)4 ℃條件下過夜孵育, PBS沖洗3次，熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS沖洗3 次，封片后熒光顯微鏡進行觀察和拍照。

1.2.7 RT-qPCR 將細胞接種在24 孔板中培養，實驗分為3 個組,分別為:Control組(DMSO)、S100A8/A9組和抑制劑組(S100A8/A9+SB203580)。RNA的檢測方法參照說明書，引物序列:GAPDH:F:5'-GTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3',R:5'-ACCACCTTCTTGATGTCATCAT-3';MMP-2:F:5'-CTGATGTCCAGCGAGTGGAT-3',R:5'-CTTCACCTCATTGTATCTCCAGAA-3';MMP-9:F:5'-CAGTACCGAGAGAAAGCCTATT-3',R:5'-CAGGATGTCATAGGTCACGTAG-3';以Control組作為對照組，計算Ct數值后，根據2-ΔΔCt算出各個組的mRNA相對表達情況。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 S100A8/A9蛋白對OSCC細胞增殖活力的影響

不同濃度的S100A8/A9蛋白處理OSCC細胞24 h后,檢測S100A8/A9蛋白對細胞增殖活力的變化見圖 1，細胞增殖活力有濃度依賴性(P<0.05)。與Ang[5]等研究結果近似，在后續的實驗中，用1 μg/ml S100A8/A9蛋白處理細胞。

圖 1 S100A8/A9蛋白對SCC-25及CAL-27細胞增殖的影響

2.2 S100A8/A9蛋白對OSCC細胞侵襲遷移的影響

2.2.1 細胞劃痕實驗 結果如圖 2，與對照組相比，隨著時間變化細胞生長向劃痕的地方遷移，S100A8/A9組的劃痕區域小于同一時間點的對照組(P<0.05)。

2.2.2 Transwell實驗 結果發現S100A8/A9組(83±7.32,89±5.31)比對照組(59±5.91,57±4.88)細胞遷移數顯著要多,差異有統計學意義(P<0.001)。侵襲實驗的結果發現S100A8/A9組(80±3.91,81±3.31)比對照組(53±3.22,52±3.57)細胞侵襲數顯著要多,差異有統計學意義(P<0.001)(圖 3)。

2.3 S100A8/A9蛋白對口腔鱗癌細胞p38MAPK通路活化的影響

添加1 μg/ml S100A8/A9蛋白處理口腔鱗癌細胞后,磷酸化p38MAPK水平在0.5～6 h內明顯升高(圖 4),12 h磷酸化水平降低，而總p38MAPK蛋白表達水平無明顯影響。在存在或不存在10 μmol/L SB203580的情況下,用S100A8/A9蛋白處理細胞0.5 h,結果發現磷酸化p38MAPK水平在p38MAPK信號通路抑制后顯著下降。細胞免疫熒光染色結果中的磷酸化p38MAPK水平(圖 5)與免疫印跡檢測的結果一致，S100A8/A9蛋白對p38MAPK通路存在激活作用。

圖 2 S100A8/A9蛋白對SCC-25和CAL-27細胞遷移能力的影響(Transwell實驗，×100)

圖 4 S100A8/A9蛋白對SCC-25及CAL-27細胞p38MAPK通路的影響(Western blot)

圖 5 p-p38在OSCC細胞中的定位表達(熒光顯微鏡， ×400)

2.4 阻斷p38MAPK信號通路后S100A8/A9蛋白對口腔鱗癌細胞的侵襲和遷移的影響

遷移Transwell實驗結果發現抑制劑組(42±5.06,38±2.99)比空白組(56±2.18,57±2.14)和S100A8/A9蛋白組(87+4.10,90+3.56)細胞遷移數顯著減少了(P<0.001)。侵襲Transwell實驗結果發現抑制劑組(40±3.25,37±2.92)比空白組(52±3.16,55±2.44)和S100A8/A9蛋白組(80±4.58,81±3.81)細胞侵襲數顯著減少了(P<0.001)(圖 6)。

2.5 MMP-2和MMP-9參與S100A8/A9蛋白誘導的口腔鱗癌細胞侵襲和遷移

通過RT-qPCR檢測對照組、S100A8/A9蛋白組和SB203580組口腔鱗癌細胞中目的基因MMP-2及MMP-9和GAPDH的表達、MMP-2和MMP-9基因表達量的比值，SB203580組(0.29±0.23，0.14±0.04)的MMP-2 mRNA表達情況分別與對照組(0.89±0.50，0.49±0.21)和S100A8/A9組(2.77±0.62，1.40±0.45)相比呈低表達(P<0.001)。SB203580組(0.15±0.09，0.20±0.09)的MMP-9 mRNA表達情況分別與對照組(0.55±0.27，0.72±0.25)和S100A8/A9組(1.30±0.44，1.27±0.32)相比呈低表達(P<0.001)。

3 討 論

S100蛋白家族是一個由小分子量蛋白(10000～20000) 組成的鈣結合蛋白家族，特異性表達于脊椎動物中，共有25名成員。S100A8/A9蛋白是S100蛋白家族重要的蛋白，位于1號染色體長臂2區1帶，該區域穩定性差，可能與惡性腫瘤發生具有密切關系[6]。S100A8和S100A9常以同源二聚的結構存在,通過結合成穩定復合物而發揮作用，但由于二聚體通常不可檢測，這也給S100A8/A9蛋白的研究帶來了困難和挑戰[7]。S100A8和S100A9在腫瘤細胞中主要通過免疫的細胞表達，通過與多種靶蛋白(包括酶，細胞骨架亞基，受體，轉錄因子)的相互作用發揮細胞因子和趨化因子作用，激活級聯信號和觸發細胞反應，從而促進

圖 6 p38MAPK通路在 S100A8/A9 蛋白質促進SCC-25及CAL-27細胞遷移和侵襲能力中的作用(×400)

腫瘤生長和轉移[8]。本課題組前期研究發現S100A8和S100A9在OSCC細胞間基質中的浸潤細胞中表達，其在組織中表達量的高低與OSCC轉移和侵襲相關，可作為預測預后的標志[9-10]。近來有研究報道，骨髓移植后小鼠的腫瘤模型，研究發現腫瘤微環境中的骨髓衍生細胞表達的S100A8/A9對于促進腫瘤發生是必需的[11]。因此，S100A8/A9蛋白可能作為藥物靶點,在將來探索新的治療腫瘤的方法將具有重要的臨床價值。本實驗觀察到：S100A8/A9蛋白在OSCC細胞增殖活性中表現為濃度依賴性，高濃度(>35 μg/ml)抑制OSCC細胞的生長，低濃度(<35 μg/ml)促進OSCC細胞的生長，與國外研究結果一致，隨后實驗中探究低濃度S100A8/A9蛋白下對OSCC細胞的遷移和侵襲的影響，結果表明低濃度S100A8/A9蛋白能夠增加OSCC細胞的遷移和侵襲能力，對其機制做了進一步探討。

腫瘤侵襲轉移過程是一多基因、多因素作用及多步驟過程，研究表明，S100A8/A9 通過與交互模式識別受體如Toll 樣受體或晚期糖基化終末產物受體，激活 MAPK 和 NF-kB 信號通路來調節自分泌和旁分泌，促進腫瘤轉移前微環境形成，從而加快腫瘤的發展。p38MAPK是MAPK信號通路關鍵的信號轉導路徑之一，p38MAPK激活后磷酸化下游轉錄因子和蛋白激酶，激活特定的細胞內信號級聯如MMPs,調控著細胞的遷移和侵襲[12]; MMPs可以誘導腫瘤細胞和細胞外基質的降解,MMPs表達量的變少直接導致ECM重構，因此也被認為是腫瘤侵襲和轉移的標志[13]，MMPs中其MMP-2和MMP-9是腫瘤的侵襲和轉移的良好標志，在小鼠肝癌模型中，敲低S100A8和S100A9基因，肝轉移灶的MMP-2和MMP-9的表達量降低[2]。因此，p38MAPK信號通路被認作是腫瘤細胞的侵襲和遷移中關鍵的通路,抑制其信號通路，細胞的遷移和侵襲也受到影響[14];小鼠腫瘤模型的初步實驗表明，特異性靶向阻斷p38MAPK信號通路可抑制體內肺癌的形成[15]。國內外雖然對OSCC的遷移和侵襲有一些研究，但其分子機制尚未明確報道。本實驗觀察到：S100A8/A9蛋白能夠增加p-p38MAPK的蛋白表達量， MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達量也出現上調，為了進一步研究抑制p38MAPK通路后，p-p38MAPK的蛋白表達量降低，MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達量明顯降低，表明其對p38MAPK通路有激活作用，同時在細胞免疫熒光染色中細胞質和細胞核內觀察到p-p38MAPK 表達量增高，隨后在遷移和侵襲實驗中，同樣抑制了p38MAPK通路，OSCC細胞遷移和侵襲能力也隨之減弱，進一步驗證低濃度S100A8/A9蛋白增加OSCC細胞遷移和侵襲過程中參與了p38MAPK通路, 提示低濃度S100A8/A9蛋白可能通過激活p38MAPK通路促進OSCC細胞遷移和侵襲。

綜上所述, 低濃度 S100A8/A9蛋白可以促進OSCC細胞遷移和侵襲，其機理可能是活化了p38MAPK通路。目前S100A8/A9蛋白作為OSCC治療的藥物具有巨大的開發前景，本研究由于S100A8/A9蛋白復合物的基因敲除技術難度高并缺乏體內實驗，造成了一定的局限性，本課題組后期將解決這些問題來進一步驗證。其本次研究的結果及進一步的深入研究將為開發新的OSCC治療藥物提供新的靶點和理論基礎。