口腔鱗癌葉酸表達的臨床病理分析

楊艷 陳盛 蒲玉梅 王育新

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)，簡稱口腔鱗癌，是口腔頜面-頭頸部最常見的上皮源性惡性腫瘤。除手術治療外，化療是治療OSCC的主要方法之一，尤其對于晚期OSCC患者或不能耐受手術治療的患者，化療可能延長患者生命。

目前非靶向化療存在靶向性差，系統毒性高等缺點，以VEGF、EGFR等為靶點的主動靶向化療逐漸受到臨床醫師和患者的關注[1-3]。葉酸受體(folate receptor，FRα)在正常組織中往往低表達，而在卵巢癌、肺癌等大多數腫瘤組織中高表達，因此以FRα為靶點的靶向化療成為研究熱點[4-6]。目前OSCC中葉酸表達仍不明確，本研究通過分析不同分型、臨床分期、腫瘤浸潤方式中FRα表達并分析其與患者預后相關性，為FRα靶向治療OSCC提供臨床病理學參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取南京大學醫學院附屬口腔醫院口腔頜面外科2012 年1 月～2013 年12 月就診并行手術治療的OSCC患者，甲醛固定石蠟包埋組織標本95 例，同一患者術后切緣病理證實為正常口腔黏膜組織標本作為對照組。所有患者術前均未接受放化療、激素及其他輔助治療，術后診斷均經病理證實。

1.2 臨床隨訪

對95 例OSCC患者均進行隨訪，隨訪時間最短為6 個月 , 最長為80 個月, 平均隨訪時間31.3 個月。分析所選患者性別、發病部位、淋巴結轉移情況、病理分級對患者預后的影響及與葉酸表達之間的相關性。

1.3 免疫組化

采用兔抗人FRα單克隆抗體(Abcam，英國)。以1∶100稀釋的山羊IgG為陰性對照。采用免疫組化方法對石蠟包埋的OSCC標本進行免疫組化分析。具體方法如下：二甲苯脫蠟后，梯度乙醇水化，抗原修復方法是：EDTA修復液(pH 9.0)的電磁爐中加熱，煮沸后計時15 min，然后冷卻至室溫(約20 min)。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗后，山羊血清封閉10 min，不洗，甩干，以1∶100稀釋的抗FRα一抗4 ℃冰箱孵育過夜，用PB沖洗。然后用K5007二抗(DAKO，丹麥)在室溫下孵育20 min，PBS沖洗3 次，每次3 min，DAB顯色，鏡下控制顯色時間。最后用蘇木精復染1 min，自來水沖洗1 min，鹽酸乙醇分化3 s，自來水沖洗3 min，1%碳酸鋰藍化，自來水沖洗3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明封片，完成免疫組化。

1.4 FRα陽性判斷標準

所有組織切片均由一名病理學家評估。切緣病理證實為正?？谇火つど掀ひ啾辉u估并分級。FRα陽性表達為發生特征性的膜和細胞質免疫反應，胞漿內出現棕黃色顆粒。采用免疫組化評分法進行分析。依據細胞染色強度分為未染色(0 分)、淡黃色(1 分)、棕黃色(2 分)、棕褐色(3 分)。隨機選擇5 個視野，依據陽性細胞所占比例分為0%～1%(0 分)、2%～10%(1 分)、11%～50%(2 分)、51%～80%(3 分)、81%～100%(4 分)[7](圖 1)。

1.5 統計學方法

采用Mann-Whitney秩和檢驗比較不同性別，不同病理分級，不同浸潤方式，不同T分期，不同部位，及有無淋巴結轉移患者的FRα表達情況。采用Kaplan Meier曲線和log-rank檢驗將各組患者FRα表達與DFS、OS進行相關性分析。P<0.05在所有分析中被認為具有統計學意義。

圖 1 FRα在OSCC組織標本中的表達(IHC)

2 結 果

2.1 臨床病理資料

對95 例OSCC患者病理標本進行分析。其中68 例(71.6%)病理證實無頸部淋巴結轉移，27 例(28.4%)存在頸部淋巴結轉移。年齡范圍29～82 歲，中位年齡60.25 歲，男女比例約1.26∶1。病理分級為低分化4 例(4.2%)，中分化59 例(62.1%)，高分化32 例(33.7%)。腫瘤浸潤方式(worst pattern of invasion,WPOI)： WPOI 1～3 級66 例(69.5%)，WPOI 4～5級29 例(30.5%)。T分期：T 1-2為21 例(22.1%)，T3為63 例(66.3%)，T4為11 例(11.6%)。腫瘤原發部位：舌40 例(42.1%)，頰21 例(22.1%)，口底9 例(9.5%)，牙齦19 例(20%)，腭部6 例(6.3%)。

2.2 臨床隨訪資料

所有OSCC患者中位生存時間為3.89 年。3 年和5 年的總生存率(overall survival,OS)分別為72.6%和71.5%，3 年和5 年的無病生存率(disease-free survival,DFS)分別為74.7%和73.1%。

2.3 FRα的表達情況及與OS，DFS的相關性

所有OSCC患者葉酸表達情況分為3 組：FRα 0-1為低表達組，FRα 2-3為中表達組，FRα4為高表達組。低表達組為40 例(42.1%)，中表達組46 例(48.4%)，高表達組(9.5%)(圖 2)。

圖 2 OS及DFS與WPOI分級和FRα表達差異的相關性

表 1 臨床病理資料與葉酸表達相關性

FRα表達在男女間無顯著性統計學差異(P=0.304)，腫瘤原發部位間無統計學意義(P=0.846)，而在病理高、中、低分化間(P=0.017)，浸潤方式間(P=0.036)，T分期(P=0.002)，術前淋巴結轉移患者與非轉移患者間有統計學差異(P=0.005)(表 1)。

FRα表達量與5 年OS呈負相關，FRα高、中、低表達分別為33.4%、79.4%、90.1%(P=0.000 3)；FRα表達量與5 年DFS方面也呈負相關，FRα高、中、低表達分別為44.7%、82.9%、69.5%(P=0.033 6)。

3 討 論

葉酸在細胞快速分裂和生長中起著重要作用，如參與嘌呤、嘧啶的合成，進一步合成DNA和RNA；參與多種氨基酸的代謝等。FRα能夠以胞吞的形式將葉酸運輸到細胞內，癌細胞為了滿足自身合成的需要，可能通過上調FRα的表達量提高其對葉酸的攝取能力。FRα分為3種亞型FRα、FRβ 和 FRγ。FRα表達于大部分癌癥組織的上皮細胞中，而絕大多數正常細胞(除腎臟、胎盤)其表達量極低；FRβ在非上皮組織的癌癥細胞中過表達(髓細胞性白血病、惡性肉瘤)，而在造血細胞和非上皮細胞(脾臟、胸腺)表達量不高；FRγ在人體內分布較少。研究表明FRα過表達的癌癥包括卵巢癌、肺癌、腎癌、子宮內膜癌、乳腺癌、腦癌、結腸癌等[8-10]，FRα已成為腫瘤靶向治療的靶點。然而，OSCC的FRα研究少見且具有爭論[11-12]。

本研究表明，FRα在OSCC中有相當比例的表達，且其FRα表達量與病理分級，WPOI，腫瘤分期及淋巴結轉移之間存在相關性，這表明FRα表達可能是一種更具侵襲性的腫瘤表型的標志物。

影響OSCC患者OS和DFS的因素包括病理分級、WPOI、腫瘤臨床分期、淋巴結轉移情況、腫瘤厚度等。本研究將葉酸表達量與患者臨床病理資料分別行相關性分析，發現FRα表達在性別與腫瘤原發部位之間無統計學意義，而在病理高、中、低分化之間(P=0.017)，浸潤方式之間(P=0.036)，T分期(P=0.002)，術前淋巴結轉移患者與非轉移患者之間有統計學差異(P=0.005)，由此證明葉酸表達與腫瘤細胞增殖及轉移存在相關性。分析原因，考慮葉酸是細胞快速分裂和生長中所必須，因此腫瘤細胞在增殖分化、轉移中需要大量的葉酸來參與能量代謝。Ki-67人體中增生細胞核中的標志性抗原，能比較準確地反映細胞的增殖情況。有文獻證實葉酸表達與Ki-67存在高度相關性[13]，由此證明葉酸也可作為一種重要的觀察癌細胞增殖及轉移能力的指標。

以FRα為靶點的靶向給藥策略，在新型抗腫瘤藥物的研究和開發中已顯示出廣闊的應用前景。因此了解FRα在OSCC和其他惡性腫瘤中的存在和表達水平可以為更好的治療提供依據。然而國內外對于OSCC組織中FRα的表達情況報道少見。Saba等[11]報道了FRα表達于頭頸鱗癌中，且FRα高表達與較差預后相關，而Sun等[12]發現在頭頸鱗癌病理標本中，巨噬細胞FRα高表達，癌細胞為低表達甚至不表達。由此可見，FRα在頭頸鱗癌的表達情況存在爭論，使得FRα靶向化療在OSCC中的應用缺乏臨床依據。本研究中發現在OSCC中FRα0不表達占13.6%、FRα1占28.4%，而FRα2-4占57.8%，且其表達高低與腫瘤病理分化程度、浸潤方式、淋巴結轉移存在正相關性。進一步分析葉酸表達與OSCC生存預后的關系，發現FRα表達與患者的OS和DFS亦存在相關性，FRα高表達提示患者預后較差，因此FRα表達量或許可以作為一個判斷臨床預后的免疫組化指標。確定FRα在OSCC中的表達情況，不僅可以預測OSCC預后，而且為OSCC精準治療提供了可能。

受體介導的腫瘤靶向成像和治療是以腫瘤細胞表面特異性的受體為靶點，以受體為對應的配體結合物為載體，利用兩者特異性反應，最終實現腫瘤主動靶向。在納米藥物輸送抗腫瘤藥物的靶向劑中，FRα是一種常用且有效的靶向受體[14]。FA和FRα(Kd～0.1 nmol/L)之間的高親和度將會導致FRα過表達的癌細胞增加對治療藥物的攝取[15]。Zhu等[16]應用葉酸靶向的聚合物囊泡負載紫杉醇和阿霉素聯合化療肝細胞癌，在FA高表達的BEL-7404肝癌細胞株造模的裸鼠上獲得極佳的抗腫瘤效應。Van等[17]利用FRα靶向脂質體納米復合物治療乳腺癌，在動物模型亦獲得成功。Wang等[18]制備葉酸靶向溫度敏感磁性脂質體成功治療卵巢癌。上述研究均證實FA靶向腫瘤特異性聚集，減少了對正常細胞毒性，改善了化療藥物的生物利用度。

本研究結果提示以FRα介導的靶向治療OSCC具有病理學基礎。