乙肝耐藥全基因測序分析研究

姜靜，萬浩，李徐圖，謝文英，蔣麗琳，楊瑞生，張平，孟冬梅

（武漢康圣達醫學檢驗所有限公司 營銷感染市場部，湖北省 武漢市 430000）

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一個全球性健康問題，它增加了患者肝硬化、肝癌的風險，需要終生治療。世界衛生組織報道，每年約有88.7萬人死于HBV 感染所致的肝衰竭、肝硬化或原發性肝癌。全世界約有2.57 億人患有慢性乙型肝炎，其中非洲和亞洲的感染率最高［1］。在我國60%肝硬化和80%肝細胞癌患者由HBV 感染引起［2］。核苷（酸）類抗病毒藥物是目前治療慢性乙型肝炎的主流，但核苷類似物的長期使用導致患者體內不同程度出現病毒耐藥突變。耐藥變異是HBV 經過抗病毒藥物的選擇，逐漸對治療藥物失去敏感性，從而產生抗藥性的過程。HBV 耐藥性的出現是悄無聲息的，難以無法在第一時間發現。只有當耐藥的HBV 繁殖到一定數量，才能通過現有的HBV-DNA 檢測技術發現［3］。HBV 在核苷（酸）類抗病毒藥物的作用下會發生一個或多個耐藥位點的突變。如何及時靈敏地預測耐藥株的出現，為臨床醫生提供選擇最佳替換治療方案或重新選擇治療時機顯得尤為必要。分析HBV 耐藥突變位點對于臨床抗病毒治療方案的選擇以及流行病學的研究意義重大。筆者采用全基因測序方法，隨機選取分析了2019 年1 月至2019 年5 月126 例患者的耐藥基因檢測結果，為評價藥物治療效果和合理用藥提供理論基礎，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本組126 例，男89 例，女37 例；年齡12～75 歲。所有患者均為接受核苷（酸）類藥物抗病毒治療的慢乙肝患者。核苷（酸）類藥物包括拉米夫定（LAM），阿德福韋（ADV），恩替卡韋（ETV），替比夫定（LdT）和替諾福韋酯（TDF）

1.2 主要儀器和試劑

巢式聚合酶鏈式反應（PCR）所用儀器為BIO-RAD 基因擴增儀，測序所用儀器為ABI 3700。采集患者血清，按試劑盒要求的步驟從血清中提取HBV DNA，所用試劑盒購自達安基因股份有限公司。進行巢式PCR 引物進行擴增，擴增完畢后，產物進行基因測序，檢測其耐藥位點形式。所用試劑盒為BigDye Direct Sanger Sequencing Kit。

1.3 HBV 耐藥位點分析

為確定所研究病毒群體中是否存在與所用藥物有關的耐藥突變位點，共分析25 個可能出現的耐藥突變位點。與HBV 標準序列片段進行比對，對測序結果進行位點突變分析。見表1。

2 結果

2.1 耐藥位點突變率統計結果

126 例患者中，74 例（58.7%）檢測到耐藥位點突變，主要發生在204 位點和180 位點，突變率占比分別為44%和33%。其次為181 位點，突變率占13%。主要是與LAM 耐藥相關的位置。其他位點具體如圖1 所示。其中L180M+M204V+A181G/C 的突變，已有報道［4］稱可能對ETV 耐藥，可以更好指導用藥。

表1 檢測位點及對應核苷酸和氨基酸

圖1 耐藥位點突變率

2.2 耐藥突變位點連鎖分析結果

在檢測到的發生耐藥突變的74 例患者中，發生耐藥位點連鎖突變的49 例，占66.2%。突變位點的連鎖模式達36 種，最主要的連鎖突變位點是M204V+L180M+S202G，占24.5%（12 例）。男性發生耐藥的例數為58 例，204 位點突變率為62%（39/58），180 位點突變率為53.4%（31/58），181位點突變率為22.4%（13/58），236 位點突變率為6.8%（4/58）；女性發生耐藥的例數為16 例，其中204 位點突變率為50.0%（8/16），180 位點突變率為31.2%（5/16），181 位點突變率為6.25%（1/16）；31～60 歲的患者中，180 位點變異率為61%（22/36），181 位點突變率為22.2%（8/36），204 位點變異率為83.3%（30/36），236 位點變異率為11.1%（4/36）。61 歲以上的患者中，180 位點變異率為45.5% （5/11），181 位點變異率為18.1%（2/11），204 位點變異率為45.5%（5/11），236 位點變異率為0。

HBV P 區位點突變主要集中在180、181、204和236 位點，其他位點也存在較低比例的變異。不同性別和不同年齡段的患者中，HBV P 區基因突變率尚不具有統計學意義上的顯著差異。通過測序技術檢測位點的突變，可以全面反映P 區位點的變異情況，為臨床用藥提供重要依據。應當指出的是，發生變異不一定耐藥，只有當變異株成為優勢株時才會發生耐藥。

3 討論

人們對HBV 感染的自然史和由此產生的疾病的治療潛力的認識正在不斷提高。目前，用于乙型肝炎抗病毒治療的藥物一般有兩類，一類是干擾素（IFN），一類是核苷（酸）類似物，在我國準許臨床治療應用的核苷（酸）類似物主要有5種，包括LAM，ADV，ETV，LdT 和TDF［5］。核苷（酸）類似物在臨床治療應用中為抗病毒首選藥物，其治療目的是抑制HBV 復制并最終阻止或延緩慢性乙型肝炎并發癥的發生［6］?，F階段的核苷類似物對病毒的抑制作用是通過影響反轉錄的啟動及DNA 的延伸，使病毒的復制受到抑制而發揮效用［4］。

如圖2 所示，核苷（酸）類似物間存在交叉耐藥點的問題。對于已發生變異的患者，建議臨床合理的選擇用藥，及時監測耐藥突變位點的情況，避免出現多重耐藥而增加治療難度。若已出現多重耐藥，則更應該監測其耐藥突變位點，合理優化治療方案，避免病情失去控制而進一步加重。

圖2 HBV 對應核苷（酸）類似物耐藥的基因突變位點

對研究對象進行分析得到的結果揭示耐藥發生率最高的是LAM，這也與已有文獻報道LAM 耐藥發生率高達65%～70%吻合［7］。在耐藥的處理方面最困難的是多重耐藥的出現。隨著臨床用藥，其他新的耐藥突變模式陸續出現。本研究中，A181T/V+N236T 位點突變占3 例，其聯合突變可導致LAM、LdT 和ADV 耐藥，并可顯著降低TDF的抗病毒活性。國內的研究及發現了2 例rt250V/L，rt20I，rtlS0M 和rt204V，rt202G，rt184I新的突變組合。這種新的突變模式是否也會引起ETV 耐藥或其他耐藥還需進一步驗證。其中本次分析的患者中也發現了L180M+M204V+A181G/C的突變，已有文獻報道可能對ETV 耐藥［4］?？傮w分析表明，男性的耐藥率比女性高。年齡上，61歲患者以上在236 位點的突變較少，可以指導臨床用藥。

當變異株最終推翻野生株的統治后，耐藥發展到臨床耐藥階段?；颊哐褐蠬BV DNA 水平會反彈，最終出現肝功能異常、肝臟組織學損傷。因此我們在病毒學耐藥階段及基因耐藥階段就應該盡早進行干預，及時阻止病毒學耐藥向臨床耐藥的惡性方向發展。更有利于指導用藥，減少多重耐藥突變的發生。耐藥變異位點的檢測和用藥期間的監測，可以指導臨床選擇和調整核苷酸類藥物，具有非常重要的臨床價值。