微氧EGSBBR產甲烷系統快速啟動與微生物群落特性

葛大令，周鑫，RONEL Rudy Koubode，陰澤陽，張偉

（1 太原理工大學環境科學與工程學院，山西晉中030600；2 山西省市政工程研究生教育創新中心，山西晉中030600）

厭氧處理技術是一種經濟高效的生物處理方法[1-2]，不僅可以將廢水中的有機物去除，還能回收生物能源（甲烷）[3-5]，被廣泛應用于高濃度有機廢水處理。然而產甲烷菌屬于嚴格厭氧菌，生長速率緩慢且對進水條件和環境要求苛刻，在產甲烷系統中同時存在著產甲烷菌、水解產酸細菌、產乙酸細菌競爭互營關系，若運行不當將會抑制產甲烷效能，導致產甲烷啟動時間延長、甚至失敗。近些年，微氧條件強化厭氧消化技術逐漸成為污水處理研究的關注點。在微氧條件下，兼性微生物可以快速將有機物轉化為低分子脂肪酸（乙酸）的中間產物，從而為快速甲烷產生創造有利條件[6-8]。Ruan等[9]研究表明微氧曝氣能夠促進有機物的利用，污泥的甲烷產率提高16.4%，董春娟等[10]和Hussain等[11]研究也證明微氧條件下污泥產甲烷活性要高于嚴格厭氧環境，而Zitomer 等[12]的研究表明即使是分散狀態的懸浮污泥，也能為好氧菌與厭氧菌提供共同生長的環境，且污泥呈現出高的產甲烷活性。低氧條件還具有氧利用率高、曝氣能耗小、剩余污泥產量少、有機物去除率高、抗沖擊負荷能力強，去除難生物降解物質等優勢，微氧生物處理技術在產甲烷快速啟動方面具有廣闊的應用前景。然而微氧條件容易造成絲狀菌大量生長，從而導致污泥膨脹與流失問題，增加生物填料的方式可以有效地避免污泥上浮問題，而且還可以提高反應器微生物總量，并為厭氧甲烷菌提供良好的生存微環境，保證加快反應器產甲烷啟動時間。為此，本文在高效厭氧反應器（EGSB）內結合了生物膜反應器的優點，在反應區的頂部布置固定填料床，形成膨脹顆粒污泥床生物膜反應器（expanded granular sludge blanket biofilm reactor,EGSBBR），在微氧條件下通過工藝控制研究產甲烷工藝啟動和微生物群落特性，為微氧EGSSBR反應器的設計和啟動提供前期基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗裝置

EGSBBR 小試裝置如圖1 所示。反應器由有機玻璃制成，整個系統的有效容積約為16L，由主體反應區（7L，高1.4m，內徑8.0cm）和三相分離器（9L，高0.5m，內徑19.0cm）組成。反應區包括兩部分，即膨脹顆粒污泥床（底部）和填料床（上部），填充了25%（體積分數）的聚氨酯（PU）海綿塊（8mm×8mm×8mm）作為載體。分離器位于反應器頂部，以沉淀污泥，分離處理后的廢水并收集氣體。系統出水從固定在分離器上的堰排出，其中一部分出水通過內循環泵與進水混合重新進入反應器底部。

圖1 EGSBBR裝置示意圖

1.2 接種污泥與試驗用水

接種污泥來源為山西省某污水處理廠，用濃縮池污泥（污泥濃度MLSS：15.76g/L） 和曝氣池（MLSS：7.47g/L）的體積比為2∶1 的混合物接種反應器，接種體積占反應區的40%。試驗用水為模擬有機廢水，碳源、氮源、磷源分別由葡萄糖、氯化銨、磷酸二氫鉀提供，C∶N∶P質量比為200∶5∶1。進水中還加入1mL 微量元素儲備液，其主要成分 如 下，FeCl3·4H2O （2000mg/L）、CoCl2·6H2O（2000mg/L）、MnCl2·4H2O（500mg/L）、CuCl2·2H2O（30mg/L）、ZnCl2（50mg/L）、H3BO3（50mg/L）、(NH4)6Mo7O24·4H2O（90mg/L）、Na2SeO3（100mg/L）、NiCl2·6H2O （50mg/L）、乙二胺四乙酸（EDTA，1000mg/L）。

1.3 反應器運行條件

反應器為連續流進水，投加適量稀鹽酸控制進水pH 在7.2 左右，投加碳酸氫鈉控制堿度為400～600mg/L（以碳酸鈣計），通過預充氧方式控制反應器內溶解氧在0.2～0.3mg/L 之間，為了確保中溫條件甲烷生成，整個系統通過溫度控制器加熱控制水溫在（35±1）℃，反應器整體用黑色不透光紙包裹以避光。本文以葡萄糖為唯一碳源，進水化學需氧量（COD）濃度為2000mg/L 不變，通過縮短水力停留時間（HRT）和內回流比以提高進水有機負荷（OLR）以快速完成EGSBBR 反應器產甲烷啟動。根據不同反應條件共分為3個運行階段，總共運行了48天，各個階段的運行參數如表1所示。

表1 EGSBBR在不同階段的運行參數

1.4 分析項目和方法

溫度，pH 和溶解氧（DO）通過便攜式多參數水質分析儀（WTW Multi 3420，德國）監測。每天的出水取樣并使用0.45μm 過濾器過濾，然后立即進行分析。COD 采用快速消解和哈希試劑盒進行快速測定。反應器收集到的氣體通過濕式氣體流量計測量其產氣量。氣相色譜儀型號為東西分析GC-4000A，其中氣體組分測定采用熱導檢測器（TCD），色譜柱型號為OV-101；采用氮氣為載氣，載氣流量為30mL/min，氣化室溫度為100℃，檢測器溫度為100℃，柱箱采用恒溫模式，溫度為100℃。揮發性脂肪酸（VFA）檢測器為氫火焰檢測器（FID），色譜柱型號為KB-FFAP，采用氮氣為載氣，載氣流量設為25mL/min，氣化室溫度為220℃，檢測器溫度為240℃，柱箱初始溫度為140℃。

污泥胞外聚合物（EPS）分析采用三維熒光光譜掃描（3D-EEM）分析，采用日本島津公司的RF6000 型的熒光分光光度計。實驗參數設置為：激發波長（Ex）為200～550nm，步長2nm；發射波長（Em）為200～550nm，步長5nm，掃描速度為12000nm/min，激發光帶寬為10nm，發射光帶寬為10nm，以去離子水的熒光光譜圖為空白樣。

為考察反應器系統內部微生物的群落結構，在試驗第三階段（第41d）于反應器污泥區和填料區各取適量污泥和生物膜樣品在-20℃的環境中保存待測，實驗采用Illumina-MiSeq 高通量測序平臺[生工生物工程(上海)股份有限公司]對反應器微生物基因序列進行測序以分析微生物群落結構。

2 結果與討論

2.1 產甲烷啟動性能

圖2(a)、圖2(b)所示為培養過程中出水COD 濃度、去除率的變化和反應系統產生的主要氣體組分及出水pH 的變化情況。在反應器接種后，為使微生物能盡快適應外部環境，盡快完成產甲烷啟動，系統采用較長HRT（3天）。第一階段COD去除率很低67.5%，且氣體組分主要是CO2，甲烷的濃度很少。至第一段運行結束，甲烷產氣量僅為60mL/d，甲烷轉化率僅為4.4%。在第二階段（21～33 天），氣體組分中甲烷單日產氣量呈現出十分明顯的增加趨勢，而CO2的單日產氣量則呈逐步下降趨勢，這一階段COD去除率升高到89.7%，這是因為隨著甲烷菌的活性和豐度的增長，有機物降解大量被用于合成甲烷，且系統中存在產生的CO2用于合成甲烷（氫營養產甲烷菌）而被消耗。在此階段，隨著系統產甲烷代謝活動的逐步增強；第三階段COD 去除率進一步提高到94.2%，此時有機負荷達到1.0kgCOD/(m3·d)，且產氣量較第二階段有了較大幅度的增長，該階段甲烷單日產氣量逐步趨于穩定并達到峰值，整個運行過程中最大甲烷單日產生量達582mL/d，此時甲烷的體積分數達75.62%，出水pH也從6.4（第12天）持續升高至7.6（第33天），主要是由于產甲烷代謝產生堿度所致（是不是可以認為產甲烷已啟動，若是時間是34 天）。圖2(c)展示了運行過程中出水VFA濃度和組分的變化情況。前期（1～11 天）出水VFA 濃度增加與出水COD 濃度相反的變化趨勢證明了系統水解酸化能力的加強，微生物對系統內環境逐步適應，此時出水pH從6.9逐漸降低至6.3，且由于該階段產甲烷菌的豐度較低，對VFA 的利用能力有限，系統內VFA 逐漸積累造成一定程度的酸化。第二階段開始出水中乙酸濃度占VFA 總濃度的比值總體呈上升趨勢，這與甲烷單日產氣量逐漸增加的趨勢相符，表明系統內乙酸濃度的增加有助于該類型甲烷菌的生長。出水VFA 中丙酸濃度占比整體呈降低趨勢，這可能是因為產甲烷的迅速增殖消耗大量的乙酸，促使丙酸、丁酸等VFA 向乙酸轉化為甲烷菌生長提供能量。出水VFA 濃度與出水COD 濃度的比值總體也呈上升趨勢。圖2(d)反映的是運行各階段污泥濃度的變化和污泥活性指標（MLVSS/MLSS）。接種后污泥濃度較之前有所下降，可能因為微生物尚未徹底適應反應器和水質條件。隨后開始逐步縮短HRT，并調整回流倍數使反應器內上升流速（僅計算進水流量提供的上升流速）增高，從圖2(d)中可以看到第二、第三階段的MLSS 整體呈上升趨勢，且第三階段的趨勢更為明顯，從9.3g/L 提高到12.325g/L， 污 泥 容 積 指 數（SVI） 則 下 降 至79.51mL/g，同時污泥在接種后MLSS/MLVSS 從最初的0.561增加到0.644，這表明微氧EGSBBR反應器能夠快速發生水解酸化并提供產甲烷底物，同時增加污泥濃度、提高污泥生物活性并改善污泥沉降性。

圖2 各階段反應器處理性能

表2 統計了不同反應器甲烷啟動特性相關研究。本文采用EGSBBR反應器在微氧條件下持續運行了48 天，在系統運行至第二階段結束（第34天），反應器已經具備了較高且穩定的產甲烷效果，此時COD去除率為91.5%，產氣中甲烷的體積分數為66.89%，同時反應器出水VFA濃度、pH等參數均趨于穩定，因此可以認為產甲烷快速啟動已經實現。通過與其他類型反應器相比，本文的EGSBBR系統在COD去除率、產甲烷效果和啟動時間等方面均具有顯著優勢。

2.2 EPS分析

為研究啟動過程中污泥EPS特性變化，取第Ⅰ階段（第19 天）、第Ⅲ階段（第41 天）污泥提取EPS，分析組分濃度（表3）并進行三維熒光分析（圖3）。圖2(d)中可以看出第Ⅲ階段的污泥濃度較第Ⅰ階段較有了較大的增長，表3數據也顯示出第Ⅲ階段S-EPS、LB-EPS和TB-EPS的濃度較第Ⅰ階段到均有一定程度的增長，其中蛋白質的增幅更大，顯然EPS濃度的增大有助于污泥聚集，進而促進生物量和污泥濃度的增長，這與Deng 等[18]的研究結果類似。

由圖3 可知，第Ⅰ階段污泥EPS 提取物中只出 現 了 類 蛋 白A 峰（Ex/Em=200～235nm/285～345nm)、B 峰（Ex/Em=270～300nm/300～350nm），樣品不同層EPS 提取物的熒光峰位置有不同程度的偏移，說明其化學結構及組成成分存在差異；可以發現第Ⅰ階段S-EPS、LB-EPS 提取物中A 峰的熒光區域很小，且未掃描出類蛋白B 峰，表明提取物中芳香族、色氨酸等類蛋白物質含量少，這點在表3 中蛋白質濃度上也有體現；培養至第Ⅲ階段，污泥EPS 提取物中類蛋白峰熒光強度顯著增強，還出現了類富里酸D 峰（Ex/Em=250～260nm/415～460nm）、類腐殖酸F 峰（Ex/Em=370～415nm/450～480nm）兩種峰，該階段樣品中S-EBS 和LBEPS 峰的位置相對穩定，TB-EPS 峰的位置較前兩種EPS 提取物的激發和發射波長均所增大，除此之外S-EPS、LB-EPS 和TB-EPS 的類蛋白類A 峰位置分別由（214nm/285nm）、（218nm/290nm）和（220nm/330nm）移動至224nm/330nm）、（224nm/330nm）和（226nm/345nm），TB-EPS 中B 峰位置由（276nm/345nm）移動至（284nm/350nm），表明兩種類蛋白類物質的激發和發射波長均發生了紅移，這可能是從第Ⅰ至第Ⅲ階段EPS 提取物內如羰基、氨基、羥基、羧基等官能團數量增加[19]，多糖、蛋白質濃度的顯著提高，說明了第Ⅲ階段污泥更加穩定，代謝方式途徑更加豐富，為系統中微生物不同功能菌群之間相互作用提供了良好的環境。

表2 EGSBBR與其他反應器產甲烷啟動比較

表3 第Ⅰ、Ⅲ階段污泥中EPS中多糖、蛋白質濃度

圖3 第Ⅰ、Ⅲ階段三維熒光光譜圖（S、L、T分別代表S-EPS、LB-EPS和TB-EPS）

2.3 微生物群落分布

2.3.1 微生物多樣性

取接種污泥S0和反應第3個階段（接種培養第41 天）的填料和污泥S1、S2 進行高通量測序。ACE 是表征微生物菌群相對豐度的指數。S0 的ACE 指 數為299263，遠高于S1 （19887） 和S2（17319），說明經過培養系統內菌群的相對豐度較初始接種污泥有所下降，培養環境的改變必然會導致一些不適應的菌群被淘汰，而ACE 指數中S1 較S2 稍大，這說明了生物膜結構較普通形態污泥能為更多種類的微生物提供合適的生長環境，因此生物膜相的群落相對豐度較大。Shannon 是用來表征樣品中微生物多樣性的指數。Shannon 指數越高，則群落多樣性越高，S0的Shannon指數為4.92，最低；第Ⅲ階段兩個樣本中S1 的Shannon 指數為5.38，較S2 的5.19 稍高，這是由于S1 樣品生物膜的結構相對穩定，能為不同生長范圍的微生物提供保護，因此更容易保持較高的生物多樣性。該指數越大表明優勢菌群生物量占總生物量的比重越小，反之則優勢菌群生物量占總生物量比重越大[20]。接種培養前后生物多樣性的升高使得系統中微生物群落之間的相互關系逐漸趨于復雜，生物類型更加多樣，生物能流途徑更加豐富，抗外界環境波動能力增強。

2.3.2 微生物群落構成

圖4進一步研究了門、屬水平上的微生物種群構成以分析接種前后的群落結構演替特征。由圖4(a)可知，微生物主要分布為12個門類（豐度大于1%）。其中變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi） 和 糖 化 細 菌 門（Candidatus Saccharibacteria）為主要的優勢菌群；其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）等。這些門類細菌對有機物的降解和厭氧代謝有重要的作用。 通過對3 個樣本中廣古菌門（Euryarchaeota）豐度的比較發現，接種污泥古菌門極低，占比僅為0.01%，經過3 個階段培養，污泥相和填料相的古菌門數量大幅提高，分別達到4.52%和1.08%，表明本系統能夠快速實現產甲烷菌的優勢富集。污泥相中古菌門豐度要高于填料相，其原因是由于有機物首先從EGSBBR反應器底部進入反應區，污泥相率先發生有機物代謝，隨水流上升有機基質不斷減少，因此污泥相的產甲烷菌數量要遠大于填料相。

圖4(b)是在接種前后群落總數中占比超過1%以上的細菌菌屬，包含18 個菌屬。與接種污泥S0相比，培養第3階段污泥高通量中Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、 Longilinea、 Ornatilinea 和Levilinea 菌屬在生物群落中的占比明顯增大，這與系統表現出越來越強的有機物降解能力分不開聯系，此類細菌主要以糖和蛋白質為底物厭氧發酵生長，例如Saccharibacteria_genera_incertae_sedis 能直接將葡萄降解代謝為乙酸等物質，這些微生物代謝的同時也為甲烷菌的生長提供了必要的底物條件；另 外 一 些 Phaeodactylibacter、 Aeromonas、Acinetobacter 等菌屬與接種前相比明顯減少，這可能是因為底物種類及含量的改變使部分菌種被選擇性淘汰。Methanothrix 菌屬在生物群落中的占比明顯增大，而另外一些諸如Phaeodactylibacter、Alkanindiges、Aeromonas 和Acinetobacter 等菌屬與接種前相比明顯減少。

圖4 接種污泥和第Ⅲ階段兩相污泥中微生物群落構成

本文中產甲烷菌（MPB）是產甲烷能否成功實現的關鍵功能菌。MPB 的豐度從接種污泥中的0.01%增長到4.52%（污泥相）和1.08%（填料相），經過3 個階段的培養有了顯著的富集。本系統內占絕對優勢的產甲烷菌屬為Methanothrix[21]，屬于甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales），主要通過乙酸脫羧途徑產生CH4和CO2[22]，不能利用其他產甲烷基質H2-CO2、甲酸、甲醇等進行甲烷合成，更適合在乙酸底物較高條件生長，這與圖2(c)VFA中乙酸比率升高的結果相吻合。系統內還檢測出了少 量 的 其 他 MPB 如 Methanosarcina[23]、Methanospirillum[24]、Methanosphaerula[25]，它 們 都 通過H2/CO2途徑形成甲烷進行能量代謝。不同產甲烷菌對體系中有害物質或環境因子的適應能力不同，MPB 中Methanosarcina 和Methanothrix 都屬于甲烷八 疊 球 菌 目 （Methanosarcinales） ， 而Methanospirillum 和Methanosphaerula 屬 于 甲 烷 微 菌目（Methanomicrobiales），顯然甲烷八疊球菌目更能適應反應器環境。有研究表明[26-27]，在具有高沼氣產率的反應器內，甲烷八疊球菌目占比通常要高于其他產甲烷菌，這與本文結果相符。生物膜相的產甲烷菌的發現表明EGSBBR中生物載體區有助于產甲烷菌的附著生長，可以進一步提升污泥床甲烷產率。

3 結論

（1）本文采用微氧EGSBBR為反應器，處理高濃度有機廢水，COD 2000mg/L，通過逐步縮短HRT 和增大反應區上升流速的方式經過34 天實現了產甲烷菌快速富集。

（2）系統的COD最高去除效率達到94.2%，最大甲烷單日產氣量為582mL/d，此時生物氣中甲烷的體積分數為75.62%。反應器出水VFA 變化、EPS特征均與甲烷生成量具有直接相關性。

（3）培養后污泥的多樣性較接種前有所升高。系統內微生物主要由變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和糖化細菌門為優勢門水平，屬水平上，甲烷絲菌屬Methanothrix 占據絕對的優勢，表明系統產甲烷主要是通過乙酸脫羧方式形成。