低共熔溶劑和次氯酸鈉組合預處理秸稈及在丁醇發酵中的應用

李浩，邢婉茹，許國超，倪曄

（江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122）

木質纖維素生物質在農業和林業中廣泛分布[1]。由于其可再生性、豐富性，易于獲得和廉價性，是微生物發酵生產生物燃料（如乙醇、丁醇、甲烷和氫氣）、大宗化學品（如檸檬酸和乳酸）和高附加值精細化學品的原料[2]。水稻秸稈（簡稱稻稈）是收割稻米后殘留在田間的植物殘渣，每收獲1kg 稻米可生產0.41～3.96kg 稻稈[3]。因為稻米是世界上第三重要的谷類作物，所以稻稈是世界上最豐富的木質纖維素生物質之一[4]。據統計，我國年產稻稈約1.8×108t[5]。由于稻稈在土壤中降解緩慢，并且帶有稻莖病菌和高礦物質含量，所以大部分稻稈被露天焚燒，僅有小部分稻稈被用作飼料[6-7]。然而，這種做法導致了諸如CO2、CO、NOx和SO2等污染物的排放[8-10]，嚴重危害環境安全和公共衛生[11]。實際上，稻稈中纖維素和半纖維素含量較高，可作為生產生物燃料的重要原料[3]。因此，稻稈的綜合利用已經引起越來越多的關注。

盡管稻稈可以作為生產再生能源的原料，但由于纖維素和半纖維素被木質素層緊密地包裹，因此纖維素和半纖維素的可及性受到嚴重限制[12]。為了提高生物質中纖維素對纖維素酶的可及性，需要對稻稈進行預處理以去除半纖維素和木質素，從而使纖維素暴露出來。理想的預處理方法應既能有效去除木質素和半纖維素，又具有較高的成本效益和能源效率，以及高度的生物相容性[1,13]。木質纖維素生物質預處理的方法有多種，包括堿、酸、離子液體和有機溶劑等[3,14]。其中，酸性預處理方法的研究較為深入，具有低成本、高效率破壞生物質頑抗性等顯著優勢[15-16]。但是，酸對木質素去除效果不佳，而木質素含量是影響纖維素酶對秸稈水解效率的主要因素。堿性的次氯酸鈉等對秸稈中的木質素（尤其是酸不溶木質素）具有良好的去除效果，如易守連[17]發現用次氯酸鈉溶液在75℃下處理玉米芯2h后，玉米芯中木質素去除率達到41.36%。離子液體是有前景的預處理試劑，具有低熔點、低蒸氣壓、可回收利用和良好的生物相容性等優點[18]。由氫鍵受體和氫鍵供體組成的低共熔溶劑（deep eutectic solvent,DES）是具有與傳統離子液體相似特性和更低價格的一類新型離子液體[19-20]。事實證明，DES可以有效地預處理各種木質纖維素生物質，例如玉米秸稈、玉米芯和稻稈等[21-23]。在木質纖維素生物質的綜合利用中，開發新型DES或改善DES預處理效果對生物質的利用和環境保護具有重大意義。

考慮到酸性試劑對木質纖維素生物質的有效性，基于弱酸的DES 是用于木質纖維素生物質預處理的良好試劑之一。在前期研究中，本文作者課題組合成了基于乙胺鹽酸鹽（EaCl） 和乳酸（LAC）的新型DES。為改善該酸性DES 在預處理稻稈時木質素去除率不高的問題，本文建立并優化了DES 與堿性氧化劑的組合預處理方式，采用Clostridium saccharobutylicum DSM13864菌株利用稻稈水解液進行丁醇發酵，評估了其在生物丁醇發酵中的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

水稻秸稈購買于山東澤生生物科技有限公司，經粉碎后過40目篩子，放置在4℃冰箱中備用。乙胺鹽酸鹽和乳酸購買于上海泰坦化學有限公司。纖維素酶來自青島蔚藍生物股份有限公司。丁醇發酵菌株Clostridium saccharobutylicum DSM13864購買于德國DSMZ微生物菌種保藏中心。

發酵培養基：硫酸銨2g/L，玉米漿干粉10g/L，碳酸鈣4g/L，一水合硫酸錳0.01g/L，無水磷酸氫二鉀0.5g/L，葡萄糖60g/L，pH 調至6.5，115℃滅菌20min。

1.2 實驗方法

1.2.1 EaCl∶LAC處理水稻秸稈及預處理條件優化

按照文獻[22]的方法合成低共熔溶劑EaCl∶LAC。

將50mL EaCl∶LAC 和5g 水稻秸稈加入到250mL 三口圓底燒瓶中，130℃油浴加熱，并機械攪拌處理2h。真空過濾收集處理后的水稻秸稈，并用自來水洗滌幾次，以除去殘留的EaCl∶LAC。處理后的水稻秸稈在60℃烘箱中烘干備用。

采用上述方法對預處理條件進行優化。對于預處理時間的優化，在130℃下分別預處理0.5h、1h、2h 和3h；對于秸稈加載量，僅通過將EaCl∶LAC添加量改為30mL、40mL和60mL來優化。

為了循環利用EaCl∶LAC，通過真空抽濾分離得到EaCl∶LAC，并將其在80℃下進行真空旋轉蒸發以除去殘留水分，如上操作可回收約90%的EaCl∶LAC，對于下一批次預處理，在此回收基礎上再補加10%的新鮮EaCl∶LAC 以保持每批次的體積相同。

1.2.2 EaCl:LAC和NaClO組合處理水稻秸稈

用NaClO對經EaCl∶LAC預處理的稻稈進行組合處理。將50mL 5g/L NaClO 添加到250mL 三口燒瓶中并加熱至30℃。然后向上述裝置中添加5.0g處理過的稻稈，避光浸泡24h。此步處理過的稻稈同樣用自來水洗滌幾遍后將其烘干備用。

為了達到更好的處理效果，在30℃下，將EaCl∶LAC 處理過的稻稈分別按照1∶8、1∶10、1∶12 和1∶15 的固體加載量，分別浸泡在0、1g/L、5g/L、10g/L、20g/L 和50g/L 的NaClO 溶液中，浸泡6h、12h、24h、48h 和72h，洗凈、烘干之后用于后續酶解反應。

1.2.3 稻稈的纖維素酶酶解

將1g經預處理的稻稈添加到50mL具塞錐形瓶中，并與10mL檸檬酸鹽緩沖液（pH4.8，50mmol/L）、100mg/L 氨芐青霉素以及50FPU/g 纖維素酶混合。將上述混合物在50℃和120r/min 下溫育24h。按照不同時間間隔從酶解液中取300μL 樣品，以12000r/min 離心10min，用HPLC 檢測上清液中還原性糖的濃度。其檢測條件如下：色譜柱型號為Hi-Plex H（300mm×7.7mm）柱，示差檢測器的溫度為25℃，進樣量為10μL，流動相為蒸餾水，流速為0.6mL/min，柱溫為65℃。

1.2.4 稻稈的結構表征及理化性質分析

對預處理前后稻稈中纖維素、半纖維素和木質素等含量變化按之前報道方法[22]進行測定。用掃描電子顯微鏡（5.0kV，×1200 Hitachi S-4800，日本）觀察預處理前后稻稈的表面形態變化。預處理前后稻稈的結晶度變化是通過射線源為銅靶的X射線衍射儀（XRD）在40kV 電壓和40mA 電流下進行檢測的，其中2θ 角的掃描范圍為5°～80°，步長為0.02°。

1.2.5 稻稈水解液的丁醇發酵

將梭菌發酵培養基中的葡萄糖替換為稻稈水解液，其余成分的含量保持不變，向發酵培養基中接種10%（體積分數）已傳代活化的C.saccharobutylicum DSM13864，設置3 個平行樣，將厭氧發酵小瓶置于干燥器中，抽真空（0.065MPa）后放于37℃培養箱中靜置厭氧發酵。發酵液中丙酮、乙醇和丁醇采用氣相色譜法測定，方法如下：色譜柱為PEG-2M 毛細管色譜柱，檢測器為FID，載氣為氮氣，進樣量1μL，分流比為90∶1，以異丁醇作為內標進行測定。

2 結果與討論

2.1 EaCl∶LAC處理稻稈及處理條件優化

采用乙胺鹽酸鹽和乳酸組成的新型低共熔溶劑EaCl∶LAC處理稻稈后，經酶解后產生的總還原糖濃度為29.7g/L，明顯高于未經處理稻稈酶解后的糖濃度（9.3g/L）。經EaCl∶LAC 處理后，酶解效率提高約219%。采用氯化膽堿型Foraceline[23]處理稻稈，經酶解48h后總糖濃度為21.5g/L，其處理效果同樣低于EaCl∶LAC。因此，EaCl∶LAC表現出了非常好的稻稈預處理效果。

為了得到最優的預處理效果，考察了時間與固液比對稻稈預處理效果的影響。分別將稻稈用EaCl∶LAC 在130℃下處理0.5～3h，處理后的稻稈進一步酶解得到水解液。經分析可知，酶解液中總還原糖濃度從18.03g/L （0.5h） 增加到32.10g/L（2.0h）[見圖1(a)]。進一步延長處理時間至3.0h時，總還原糖濃度略降至31.39g/L。這是由于在一定時間范圍內，隨處理時間增加，木質素與半纖維素被逐漸破壞，從而提高了纖維素的可及性，最終使得總還原糖濃度隨時間延長而增加。但處理時間過長將導致稻稈中的纖維素結構的破壞和總還原糖濃度的下降。進一步考察了1∶6、1∶8、1∶10 和1∶12等固液比（稻稈/EaCl∶LAC）對稻稈預處理效果的影響[見圖1(b)]。當固液比為1∶12時得到最高總還原糖濃度33.04g/L，略高于固液比為1∶10時的糖濃度（32.1g/L），遠高于固液比為1∶6 和1∶8 時的糖濃度[見圖1(b)]。雖然提高EaCl∶LAC添加量有利于脫除木質素，但綜合考慮糖濃度及經濟成本，選擇固液比為1∶10 進行后續研究。綜上，最終確定EaCl∶LAC 處理稻稈的條件為固液比1∶10，130℃處理2.0h。

圖1 EaCl∶LAC預處理水稻秸稈的條件優化

為了進一步提高EaCl∶LAC 的應用潛力，通過過濾分離EaCl∶LAC，再經蒸發去除殘留水分后進行新一批次預處理。在上述最佳條件下進行了6輪重復使用，總糖濃度如圖1(c)所示。在第二批處理時，總糖濃度減少至30.91g/L，僅比新鮮EaCl∶LAC 處理時低3.7%，證明了EaCl∶LAC 回收利用的可行性。在第6批處理時，總糖濃度降至26.11g/L，比新鮮的EaCl∶LAC 低18.7%，仍能達到新鮮EaCl∶LAC處理效果的80%，故EaCl∶LAC可以被回收和重復使用，大大降低了其使用成本。

2.2 組合預處理水稻秸稈

為了提高木質纖維素生物質的處理效果，組合預處理常被認為是一種有效的方法，即引入另外一種具有協同作用的試劑來促進木質素或半纖維素的脫除。堿性試劑具有易脫除木質素的效果，使用NaOH 和Na2CO3可進一步提高[Bmim]Cl 和DES 的處理效果[23-24]。因此，本研究引入氧化劑H2O2和NaCIO進行稻稈的組合預處理。首先，將新鮮的稻稈在30℃用H2O2（1%，體積分數）和NaClO（5g/L）溶液浸泡，經此處理后稻稈酶解液中總糖濃度分別為9.81g/L和23.07g/L[見圖2(a)]。NaClO在對稻稈的預處理中更為有效，不僅可以用作氧化劑，而且還具有堿性。雙重作用使NaClO 具有破壞酯鍵的能力，有利于去除木質素和改善木質纖維素生物質的孔隙率。本實驗還探索了EaCl∶LAC 和H2O2或NaClO 預處理順序對預處理效果的影響。在EaCl∶LAC 和H2O2或NaClO 的處理順序研究中，EaCl∶LAC/H2O2和H2O2/EaCl∶LAC 處理后的稻稈酶解液中總還原糖濃度分別為33.57g/L 和32.95g/L。與EaCl∶LAC單獨處理相比，H2O2組合預處理并沒有提高總糖濃度。然而，采用EaCl∶LAC/NaClO處理的稻稈酶解液中總糖濃度顯著增加至50.96g/L[圖2(a)]。更換處理順序，NaClO/EaCl∶LAC 預處理稻稈的總糖量為36.21g/L，僅比EaCl∶LAC單獨處理時高4.1g/L。結果表明：先用EaCl∶LAC 處理、再用NaClO浸泡的組合預處理方式具有最高的酶解效率，NaClO能夠進一步去除稻稈中未被EaCl∶LAC 破壞掉的木質素，使纖維素結構更好地暴露，提高了纖維素在酶解中的可及性。

圖2 EaCl∶LAC和NaClO對稻稈預處理的條件優化

對影響EaCl∶LAC/NaClO組合預處理的各種因素進行了優化。首先，采用1～5g/L等不同的NaClO添加量。隨著NaClO添加量的增加，酶解液中總糖濃度逐漸增加，當NaClO濃度為5g/L時，可獲得最高的總糖濃度62.78g/L[見圖2(b)]。在10g/L NaClO下，總糖濃度為60.52g/L，僅比50g/L NaClO 時低2.26g/L。較高的NaClO加載量會增加反應器的腐蝕和預處理成本。因此，10g/L NaClO 的加載量也可滿足組合預處理要求，其總還原糖濃度滿足丁醇發酵對糖濃度的要求。其次，通過不同時間間隔取樣來優化NaClO 浸泡處理的時間。如圖2(c)所示，當處理12h 時酶解液中總糖濃度達到60g/L，此后隨著時間的延長，總糖濃度并沒有增加，因此選擇NaClO 處理時間為12h。最后，優化固體（經EaCl∶LAC 預處理的稻稈）與液體（NaClO 溶液）的比例，考察其對處理效果的影響。當固液比為1∶8時，總糖濃度為52.70g/L。進一步增加固液比為1∶10、1∶12 和1∶15 時，總糖濃度分別為59.05g/L、60.46g/L和60.42g/L。因此，選擇固液比為1∶12。綜上，NaClO 處理的最佳條件是將稻稈（經EaCl∶LAC預處理）用10g/L NaClO在固液比為1∶12的條件下浸泡12h。

2.3 組合處理稻稈的結構表征及理化性質分析

表1總結了EaCl∶LAC和NaClO 預處理前后稻稈組成成分的變化。對于用EaCl∶LAC 和NaClO單獨處理的稻稈纖維素質量分數分別從31.5%增至50.9%和39.9%。當用NaClO/EaCl∶LAC和EaCl∶LAC/NaClO 處理稻稈后，其纖維素質量分數進一步增至64.9%和76.1%。這表明經過組合處理，尤其是經過EaCl∶LAC/NaClO 處理后的稻稈中纖維素質量分數顯著增加。稻稈經EaCl∶LAC/NaClO處理后，半纖維素去除率高達94.9%，遠高于經EaCl∶LAC 和NaClO 單獨處理稻稈的66.0%和51.9%。稻稈經EaCl∶LAC/NaClO 處理后，酸溶木質素質量分數從2.5%降低到0.5%，該效果略優于EaCl∶LAC 和NaClO 單獨處理時的效果（降低至0.9%）；EaCl∶LAC對酸不溶木質素沒有明顯的去除效果，NaClO 對酸不溶木質素有一定的處理效果（質量分數從27.5%降低至21.4%），而經兩者組合處理后，酸不溶木質素質量分數從27.5%降低至15.3%，這極大地彌補了EaCl∶LAC 對酸不溶木質素去除效果不佳的劣勢。經EaCl∶LAC/NaClO 預處理后，稻稈中總木質素質量分數從未處理的30%降至15.8%，脫除了約80.2%的木質素，木質素去除率遠高于EaCl∶LAC 單獨處理時的43.1%。從此結果可知，EaCl∶LAC/NaClO 組合預處理方式可彌補兩者單獨處理時半纖維素與木質素去除效果不佳的情況，從而使得稻稈中纖維素結構更易與纖維素酶作用。用EaCl∶LAC/NaClO 處理的稻稈的CrI 為60.2%，該數值為所有測試樣品中最高值（見表1）。結晶度（CrI）值增加可能是由于去除了半纖維素和木質素等無定形組分，這些成分的去除有利于提高纖維素含量[25]。預處理前后稻稈化學成分分析表明， 用EaCl∶LAC 和NaClO 組合預處理可以通過減少半纖維素和木質素，顯著增加酶水解中纖維素的可及性，這也與用EaCl∶LAC/NaClO 預處理的稻稈酶解液中較高的總糖含量一致。

表1 不同方法處理后的水稻秸稈各組分質量分數

通過SEM 分析探討了稻稈預處理前后的物理性質變化。與未處理的稻稈相比，用EaCl∶LAC處理的稻稈表面變得粗糙和皺縮。這是由于部分半纖維素和木質素的去除破壞了稻稈表面的立體結構，并暴露出內部結構。經NaClO處理的稻稈變得疏松，具有更大的比表面積。采用EaCl∶LAC/NaClO 組合處理的稻稈中，表面變得更加疏松多孔，使纖維素更多暴露出來[26]。組合處理前后稻稈表面的差異同樣揭示了半纖維素和木質素的高效去除，這有利于增強纖維素的可及性。

圖3 水稻秸稈的SEM圖

2.4 利用稻稈水解液進行丁醇發酵

探索了EaCl∶LAC/NaClO處理后稻稈的高糖酶解液在生物丁醇生產中的應用潛力。以Clostridium saccharobutylicum DSM13864 為發酵菌種，發酵培養基見2.1 節，其中實驗組以總糖濃度為60.46g/L的酶解液為碳源，對照組以60.46g/L的葡萄糖為碳源。如圖4所示，發酵過程中監測了溶劑、殘糖和乳酸隨發酵時間的變化。 以殘糖表示C. saccharobutylicum DSM13864 菌體在發酵初期的生長情況。在對照組中，發酵初期菌體快速生長。從12h 開始，菌體開始快速生產丁醇、丙酮和乙醇，直至48h 為止。發酵72h 后，發酵液中殘留8.64g/L葡萄糖，共消耗46.98g/L葡萄糖。發酵過程中產生約10.23g/L 丁醇，產率為0.22g/gglucose，時空產率為0.14g/(L·h)，總溶劑濃度達到16.87g/L，產率為0.36g/gglucose，時空產率為0.23g/(L·h)。對于實驗組，菌體生長在最初12h內存在一定的抑制情況。在發酵初始階段，對照組中監測到含有1.92g/L乳酸，并在12h內被逐漸消耗；然而在實驗組中乳酸含量為3.69g/L，這可能是菌體生長存在延滯的原因。不過，在發酵培養12h時，實驗組中乳酸也被逐漸消耗。從12h開始，實驗組中菌體開始快速生長，并在24h 開始大量產生丁醇、丙酮和乙醇。發酵72h 后共消耗了約46.73g/L 總糖，發酵液中丁醇濃度為10.16g/L，產率為0.22g/gtotalsugar，時空產率為0.14g/(L·h)。同時，發酵過程中產生了16.09g/L總溶劑，產率為0.34g/gtotalsugar，時空產率為0.22 g/(L·h)。丁醇產量高于本文作者課題組前期用[Bmim][Cl]處理的玉米秸稈水解液發酵水平（7.4g/L）[24]；同時，總溶劑產量優于Cai 等[27]經NaOH 處理后玉米芯水解液發酵效果（12.2g/L）。綜上，盡管殘留的乳酸對C. saccharobutylicum DSM13864 的生長具有一定的抑制作用，但乳酸可被梭菌利用并解除該抑制作用，利用稻稈酶解液進行發酵產丁醇的濃度和產率與葡萄糖培養基中相似。因此本實驗開發的EaCl∶LAC/NaClO處理方式，無需外源添加碳源和脫毒處理，可以直接應用于丁醇發酵。本研究通過組合酸性DES EaCl∶LAC和堿性NaClO處理稻稈的方式，極大地提高了稻稈中木質素的去除率；在充分發揮酸堿性在預處理中佛如優勢的同時，彌補了實際應用中強酸或強堿對于處理設備強腐蝕性的缺點；EaCl∶LAC的循環利用極大地降低了預處理試劑的成本。本研究獲得的稻稈酶解液不需脫毒和添加外源碳源即可用于梭菌發酵并獲得了較高的丁醇濃度。在實際應用中，可通過選育具有更高丁醇耐受性的菌株以實現更高的丁醇發酵濃度。

圖4 C.sacchrobutylicum DSM13864丁醇發酵

3 結論

本實驗開發了一種新的EaCl∶LAC/NaClO組合預處理方式用于水稻秸稈的預處理。經該方式處理后，稻稈的半纖維素和木質素去除率分別高達94.9%和80.2%。根據物理表征可知經處理后的稻稈表面變得粗糙皺縮和疏松多孔，稻稈內部的纖維素更好地暴露出來，處理后稻稈經酶解后總糖濃度可高達60.46g/L，該處理方式極大地增加了稻稈中纖維素在酶解中的可及性。稻稈酶解液可作為Clostridium saccharobutylicum DSM13864發酵生產丁醇的碳源，最終丁醇濃度為10.16g/L，產率0.22g/gtotalsugar，時空產率0.14 g/(L·h)，與葡萄糖為碳源的培養基水平相當。本實驗為木質纖維素生物質的綜合利用提供了一種高效的預處理方式，所獲得的水解液總糖濃度較高，且無需脫毒處理可直接用于丁醇發酵。